[发明专利]一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法

摘要

本发明公开了一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，主要包括步骤：制备Fe3O4/SiO2–NH2纳米微球、制备Ab/SiO2/Fe3O4、制备rGO/AuNPs/Ab、双抗夹心法制备免疫传感器、DPV检测和结果判断。本发明以还原氧化石墨烯为基板固定的AuNPs作为电化学标记，以免疫磁性纳米微球为捕获探针，用来富集待检样品中的目标物。以修饰Anti‑L.monocytogenes抗体的还原氧化石墨烯/纳米金作为非酶标记物与富集L.monocytogenes的IMNPS形成夹心结构。在外加磁场的作用下将夹心结构复合物吸附在丝网印刷碳电极表面，用差分脉冲伏安法进行分析。DPV响应信号在103CFU/mL‑109 CFU/mL有良好的线性关系，线性回归方程为y=0.02933x‑0.01996，R2=0.99367，检出限为1.8×104 CFU·mL‑1(S/N=3)，即在检测中3μL的检测样品中54 CFU的L.monocytogenes即可被检出。

主权项

1.一种非诊断目的的快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备Fe3O4/SiO2–NH2 纳米微球：FeCl3溶解于蒸馏水中，加入FeSO4，最后加入NH3· 6H2O，在无氧条件下磁力搅拌60 min，得到Fe3O4 磁性纳米材料；在反应容器中加入无水乙醇、蒸馏水、TEOS和NH3· 6H2O，搅拌均匀后加入Fe3O4 磁性纳米材料，25 ℃下搅拌24 h，得Fe3O4/SiO2 磁性纳米材料；在反应容器中加入无水乙醇、APTES和Fe3O4/SiO2 磁性纳米材料；25 ℃下搅拌24 h，得到Fe3O4/SiO2–NH2 纳米微球；（2）制备Ab/SiO2/Fe3O4：Fe3O4/SiO2–NH2纳米微球加入2.5%的戊二醛， 25℃避光磁力搅拌3 h，氨基活化后加入Anti‑L. Monocytogenes(Ab)， 25℃下搅拌 2 h后用BSA封闭非特异性结合位点，得Ab/SiO2/Fe3O4 (IMNPS)；（3）制备rGO/AuNPs/Ab：氧化石墨烯溶于蒸馏水中，加入 HAuCl4，加热至煮沸，迅速加入柠檬酸钠反应，得rGO/AuNP纳米材料；往rGO/AuNPs纳米材料中加入Anti‑L. monocytogenes (Ab)，在4℃下孵育12 h，用BSA封闭非特异性结合位点，得rGO/AuNPs/Ab纳米材料；（4）构建双抗夹心法：在待测样品溶液中加入步骤（2）所得Ab/SiO2/Fe3O4(IMNPS)，混合均匀后25℃下孵育40min，PBS洗，得到IMNPS免疫吸附L. monocytogenes的复合物，再加入步骤（3）所得rGO/AuNPs/Ab，混合均匀后25℃下孵育40min，PBS洗涤，得到rGO/AuNPs/Ab/L. monocytogenes/ IMNPS；取rGO/AuNPs/Ab/L. monocytogenes/ IMNPS滴加到丝网印刷电极工作电极表面，同时在工作电极背面放置磁铁，保证rGO/AuNPs/Ab/L. monocytogenes/ IMNPS复合物牢固的吸附在工作电极表面；（5）DPV检测：在工作电极表面滴加100μL 0.2M HCl 测试底液，进行DPV检测，其中对电极为碳电极，参比电极为 Ag/AgCl电极，用 DPV 进行表征并定性判断免疫电极；DPV检测方法的设置：氧化电位1.25 V，氧化时间 120 s，DPV电位扫描范围为1.0V‑0.0V；获得峰电流值y；（6）结果判断：将峰电流值y代入公式：y=0.02933x‑0.01996，计算出L. Monocytogenes菌浓度x值。