[发明专利]一种从沙米组织中提取总DNA的方法

摘要

一种从沙米组织中提取总DNA的方法，包括试剂盒设备提取前处理，提取步骤，质量检测；该方法针对现有沙米DNA提取技术的不足，结合beta‑巯基乙醇和天根生化科技(北京)有限公司商用DNA提取试剂盒Plant Genomic DNA Kit，通过优化试验，开发出了针对沙米组织，提取高质量、高产量和无蛋白质和RNA的污染的总DNA的方法；该方法不仅奠定了沙米基因组的开发及抗逆资源的挖掘的基础，并为提取高质量的荒漠植物全基因组DNA提供了范例。

主权项

一种从沙米组织中提取总DNA的方法，该方法包括试剂盒设备提取前处理，提取步骤，质量检测；其特征在于：所述试剂盒设备提取前处理包括：将离心管、药勺和研钵用铝泊纸包裹，高压蒸汽灭菌和干燥；用 70%酒精喷雾清洗离心机、试验台、试管架和移液器，然后用无菌纸巾擦干，反复2‑3次，确保实验台及实验所有仪器及设备无污染；所述提取步骤包括：步骤1）在植物基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit，Tiangen, Beijing, China)的缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入17 mL和60 mL的无水乙醇， 上下颠倒，充分混匀，备用；步骤2）在2 ml离心管中加入Plant Genomic DNA Kit (Tiangen, Beijing, China) 缓冲液GP1800 μL,再加入8μL的β‑巯基乙醇,盖上盖子,在涡旋振荡器上轻轻振荡,充分混匀,置于65℃水浴锅预热；步骤3）在千分之一电子天平上称取植物沙米新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分碾磨成粉末；步骤4） 将研磨好的粉末迅速转移到步骤2）中准备好的离心管中，迅速颠倒混匀；然后，将离心管放在65℃水浴20分钟；水浴过程中颠倒离心管数次，使得混合样品均匀加热，达到彻底裂解；步骤5）在步骤4)中混合样品中加入800μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm离心5分钟；步骤6）将步骤5）中上层水相小心地转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀；弃掉下层含有氯仿混合溶液相；步骤7) 将步骤6）中混匀的液体分两次转入吸附柱CB3中，12,000 rpm离心30秒,弃掉废液；步骤8） 加500μL缓冲液GD到步骤7）中的吸附柱CB3上，然后12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；步骤9）加700μL 漂洗液PW到步骤8）中的吸附柱CB3，然后12,000 rpm离心30秒，倒掉废液，再次将吸附柱CB3放入原收集管中；步骤10）重复操作步骤9）；步骤11) 将吸附柱CB3放回原收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；步骤12）将步骤11）中的吸附柱CB3转入一个干净的新离心管中，悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE到吸附膜的中间部位，然后室温放置2~5分钟；之后，12,000 rpm离心2分钟,将溶液收集到离心管中，并存放在‑80℃冰箱；所述质量检测包括：Nanodrop 检测DNA质量：在NanoDrop 2000 仪器设定检测物质为DNA，用移液器移取l μL上述步骤提取的沙米（Agriophyllum squarrosum）组织DNA，结果要求在260 nm 处有完美的DNA峰型，260/230 的值大于2.0；260/280的值在1.8~2.0之间；琼脂糖电泳检测DNA质量：用移液枪移取2 μL于6×loading buffer中，然后排入到预制Gel‑red的1.5%琼脂糖胶孔中；设置电压180 V/cm，使用北京六一琼脂糖水平电泳槽DYCP‑31BN，电泳15分钟；用BioRad凝胶成像仪检测并照相，结果显示仅有一条清晰可见的条带为合格。