[发明专利]一种同时检测五种呼吸道病毒的RT‑PCR方法所用的五对上下游引物

摘要

一种同时检测五种呼吸道病毒的RT‑PCR方法所用的五对上下游引物，属于生物工程技术领域。本发明结合无锡地区常见呼吸道病毒的流行特性，为建立一种能同时检测腺病毒（ADV）、人偏肺病毒（MPV）、人博卡病毒（BOV）、呼吸道合胞病毒（RSV）和人鼻病毒（HRV）五种呼吸道病毒的多重PCR方法，提供五对上下游引物。该方法可以在一个反应体系中检测多种病毒，简化了实验过程，缩短了实验时间，降低了实验成本，提高了检测效率。

主权项

一种同时检测五种呼吸道病毒的RT‑PCR方法所用的五对上下游引物，其特征在于：引物设计：分别设计针对ADV、BOV、MPV、RSV、HRV基因组保守区的五对引物如下：ADV上游引物：5'‑GACATGACTT TCGAGATCGA TCCCATGGA‑3’，ADV下游引物：5'‑CCGGCTGAGA AGGGTGTGCG CAGGTA‑3’ ，产物大小：139bp；BOV上游引物：5'‑TATGGCCAAG GCAATCGTCC AAG‑3’，BOV下游引物：5'‑GCCGCGTGAA CATGAGAAAC AGA‑3’ ，产物大小：291bp；MPV上游引物：5'‑GTGATGCACT CAAGAGATAC CC‑3’ ，MPV下游引物：5'‑CATTGTTTGA CCGGCCCCAT AA‑3’ ，产物大小：199bp；RSV上游引物：5'‑TTAACCAGCA AAGTGTTAGA‑3'，RSV下游引物：5'‑TTTGTTATAG GCATATCATT G‑3' ，产物大小：250bp；HRV上游引物：5'‑CAAGCACTTC TGTTTCCC‑3’，HRV下游引物：5'‑CACGGACACC CCAAAGTAGT‑3’，产物大小：390bp；设计的单一引物对病原的目标片段分别都能扩增出来，分别将五种病原的引物的各对40µM的上下游引物按体积比1︰1 混合，再将引物ADV︰BOV︰MPV︰RSV︰HRV按体积比1︰3︰2︰2︰1混合，混合后的引物作为本发明的使用引物；提取呼吸道标本的总核酸DNA&RNA；PCR检测的反应体系为25µL，包括Enzyme Mix 1µL，5 X buffer 6µL，dNTP 1µL，混合后的引物4.5µL, 待检模版5µL, 水补充至25µL，待检模板为从呼吸道标本中提取的总核酸，Enzyme Mix、dNTP及5 X buffer为QIAGEN OneStep RT‑PCR Kit试剂盒提供；PCR检测的反应程序为：50℃ 30min；95℃ 15min；94℃ 变性30sec，50℃ 退火30sec，72℃ 延伸1min，35个循环；72℃ 10min。