[发明专利]一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法有效
申请号: | 201610670350.8 | 申请日: | 2016-08-15 |
公开(公告)号: | CN106048066B | 公开(公告)日: | 2019-08-13 |
发明(设计)人: | 张涛;黄兴琳;陆俊杏;廖冰楠;白瑞英 | 申请(专利权)人: | 重庆师范大学 |
主分类号: | C12Q1/6895 | 分类号: | C12Q1/6895 |
代理公司: | 重庆创新专利商标代理有限公司 50125 | 代理人: | 宫兆斌 |
地址: | 401331 *** | 国省代码: | 重庆;50 |
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摘要: | 本发明提公开一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法。本方法包括设计引物、牡丹基因组DNA的提取、扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测等步骤。本方法通过PCR反应扩增微卫星片段,将扩增产物进行凝胶电泳检测,条带丰富,不使用同位素实验过程简单、实用、耗时短成本低的效果,并且具有标记数量多,随机分布于动植物整个基因组;每个标记等位位点有较高多态性,多态信息含量高;标记呈孟德尔方式遗传,共显性标记;实验操作过程对DNA质量要求不高,DNA用量少,可靠性好,重复性好;适合油用牡丹属SSR分子标记的扩增,还改进了聚丙烯酰胺凝胶电泳中银染的方法,既节省时间,又节约成本,进一步提高了SSR分子标记在牡丹属上应用的效率。 | ||
搜索关键词: | 一种 ssr 分子 标记 技术 牡丹 方法 | ||
【主权项】:
1.一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法,其特征在于:包括以下步骤:步骤一、引物序列引物1:F:5’‑AACTGCTGAGGGCATAGAG‑3’R:5’‑CATGATGTTGAGCCACCC‑3’;引物2:F:5’‑ACCTCCTAGACCCAGAGC‑3’R:5’‑GCAACAATCCTGGTAGTGA‑3’;引物3:F:5’‑CAATCCGAGTCGTAAGC‑3’R:5’‑CACCTCCTAGACCCAGAG‑3’;引物4:F:5’‑GGGGACTCAAATCCTTGCGAAAACCA‑3’R:5’‑AGGCCTAGTTTTGGTCTGGGCG‑3’;引物5:F:5’‑AGGAGATTGACCGATTGATA‑3’R:5’‑CTGTCTGGCATGGAACG‑3’;引物6:F:5’‑GACCGATTTGACCCTCTA‑3’R:5’‑CTCCCATGTGATGTTGTG‑3’;引物7:F:5’‑TCCTAGACCCAGAGCACC‑3’R:5’‑GATGTCCCTGAGCCAAGT‑3’;步骤二、牡丹基因组DNA的提取1)向离心管中预先加入1mlCTAB抽提液及20μl的β‑巯基乙醇,混匀,65℃预热;2)称取0.20g幼叶用液氮磨成粉末,转入步骤1)离心管中,摇匀,于65℃水浴45min;3)冷却至室温后加入等体积氯仿或异戊醇,混匀使乳化10min,10000rpm室温离心10min;4)吸取上清液加入与上清液等体积的异丙醇混匀,得到白色絮状沉淀;5)将白色絮状沉淀进行漂洗;6)漂洗后白色絮状沉淀于37℃以下的恒温箱中干燥至半透明;7)用500μl1xTE溶解沉淀,溶解后‑20℃保存;三、扩增反应1)将引物稀释到10μmol/l后备用;2)在PCR离心管内配制20μlPCR反应液;3)PCR反应程序:将配制好的PCR反应液,置于PCR仪内,进行PCR反应,反应程序为:94℃预变性3min,94℃变性30s,退火30s,72℃延伸1min,30个循环;四、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测1)在8%聚丙烯酰胺凝胶,倒入1×TBE电泳缓冲液,没过短板约2~3mm;2)吸取2~3μl样品加入到样品孔中,在待测样品左侧的样品孔里加入2μl适合的DNA分子量标记以作参考;3)接上电源连接线,打开电泳仪开关,选用稳压模式,电压选择100v,开始电泳;4)取下凝胶,超纯水中浸泡2分钟,倒掉超纯水,加入400ml0.05%硝酸银溶液,置于摇床上50rpm,染色10~15分钟,冲洗;5)加入新配制好的显色液,50rpm轻摇5~10分钟,直至条带清晰可见,倒出显色液,用超纯水冲洗凝胶后捞出,扫描图像,储存文件;五、数据处理使用凝胶成像系统分析软件,对所扫描的图片进行分析,可根据标准分子量的大小,计算目的条带的分子量大小,并记录;六、分析结果。
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