[发明专利]一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法

摘要

本发明公开了一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，具体步骤如下：（1）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体的构建；（2）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒毒种的拯救；（3）病毒扩增；（4）收集病毒颗粒；（5）病毒纯化；（6）半成品配制。本发明方法制备的活载体疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。

主权项

一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体的构建：将来自于A/Anhui/01/2013 的H7N9 亚型禽流感病毒株HA（简称AH‑HA）及来自于A/Netherland//03的H7N7亚型禽流感病毒毒株HA（简称NL‑HA）序列合成后，引物设计在5’端引入酶切位点，在3’端引入酶切位点，PCR扩增出目的片段后，用1%琼脂糖凝胶电泳回收后用相应酶切位点进行酶切，与pGA1载体连接后转化Top10感受态；测序正确后用特用酶进行酶切，并与线性化的pAd5进行同源重组，酶切及测序正确后保存，待转染重组；（2）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒毒种的拯救：酶切线性化重组腺病毒质粒、并转染至293细胞，定期观察有无细胞病变出现，大约在10天左右收集原代病毒液，反复冻融后传代；第2代以后的重组腺病毒感染Trex 293细胞后可以出现明显的病变，即细胞皱缩、变圆、脱落和死亡；传第3代病毒液感染293细胞，48 h后收集细胞，经western blot鉴定HA抗原均可以正确表达；从而建立携带H7亚型禽流感重组腺病毒活载体疫苗种子批毒种；（3）病毒扩增：a、采用175cm2 培养瓶，每瓶各加入107 293细胞进行培养；b、将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，37℃ 培养90分钟，此时MOI 值约为25；c、向培养瓶加入DMEM 至30ml/瓶，再培养48‑72 小时，此时有3×1011～3×1012 个病毒，若需要，进行MOI 测定估计病毒滴度；（4）收集病毒颗粒：先收集培养瓶中被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM中，‑20℃ /37℃ 冻融3次，离心沉淀细胞碎片，可得到病毒颗粒；（5）病毒纯化：用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒颗粒，以10000g/min 的速度离心4小时，得到H7亚型禽流感病毒基因工程活载体疫苗的原液；（6）半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，用腺病毒专用稀释液T101稀释，使携带不同H7亚型禽流感病毒HA复制缺陷型重组腺病毒达到1010vp/ml，即配制成H7亚型禽流感病毒活载体疫苗的半成品。