[发明专利]一种烟草中根结线虫的鉴定方法

摘要

本发明公开了一种烟草中根结线虫的鉴定方法，所述的鉴定方法集形态和分子特征为一体，包括：1）形态学鉴定；2）提取DNA；3）LSU 28S rDNA D2‑D3序列扩增：用根结线虫通用引物RK28SF/MR对步骤2中已提取的DNA进行PCR扩增，检测，如果得到大小为614bp 的序列，则初步鉴定为根结线虫，进行分子系统发育树的构建；4）分子系统发育树的构建，通过系统发育关系分析确定待测线虫是否为根结线虫；5) 序列特征扩增区域 SCAR‑PCR 检测。本发明为烟草根结线虫种类的高效、准确鉴定提供了强有力的技术体系，为掌握根结线虫在烟草种植区的分布及危害程度提供了良好基础。

主权项

一种烟草中根结线虫的鉴定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：1）形态学鉴定：采用五点取样法，从典型的烟草病株上采集病根标本连同500g的根际土壤装于密封袋中；从采集的病根标本及土壤中分离出线虫，采用玻片加热方法进行线虫的杀死，用TAF液固定，然后制作线虫玻片标本，来不及处理的样本，将其装入密封袋放入4 ℃冰箱保存；在光学显微镜下进行线虫的形态特征观察并使用测微尺进行线虫各形态特征值的测量，或通过配在显微镜上的绘图仪在纸上绘出虫体后再进行测量，完成测量后，按照De Man公式计算线虫的形态特征测量值，统计测量值，拍摄重要形态特征图片，完成形态学鉴定，初步鉴定出同种线虫；2）提取DNA：取5～10条步骤1初步鉴定出的同种线虫的雌虫，挑至盛有蠕虫裂解液的1.5mL的离心管中；将上述离心管放入65～70℃的水浴锅恒温加热1h以上，然后95℃加热15min，即可得到线虫的DNA提取液，4℃下保存备用；3）LSU 28S rDNA D2‑D3序列扩增：用根结线虫通用引物RK28SF/MR对步骤2中已提取的DNA进行PCR扩增，上游引物为 RK28SF ：5´‑ CGGATAGAGTCGGCGTATC‑3´，下游引物为MR ：5´‑ AACCGCTTCGGACTTCCACCAG ‑3´，对线虫LSU 28S rDNA D2‑D3区片段的序列进行扩增，纯化，然后对所得的PCR扩增产物电泳检测，如果得到大小为614bp 的序列，则初步鉴定为根结线虫，接着进行分子系统发育树的构建；如果得不到大小为614bp的条带，则不是根结线虫，不再进行鉴定；4）分子系统发育树的构建：将经过步骤3扩增、纯化及检测得到的序列在NCBI中进行BLAST比对，选出匹配高的序列，然后利用MEGA软件构建线虫系统发育树，步骤包括序列比对、编辑、选择建树算法和系统发育树的测试；所述建树算法为邻位相连法NJ，所述系统发育树的测试采用自助法Bootstrap，重复次数设为1000；对构建的分子系统发育树进行分析，如果待测线虫以≥99%的支持度与来自GenBank的根结线虫种群归在一个支系，则说明待测线虫为根结线虫；5) 序列特征扩增区域 SCAR‑PCR 检测：Mi‑F/Mi‑R和Inc–K14F/Inc–K14R为南方根结线虫的特有引物，所述Mi‑F序列为5’‑GTGAGGATTCAGCTCCCCAG‑3’，Mi‑R序列为5’‑ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC‑3’；所述Inc–K14F序列为5’‑GGGATGTGTAAATGCTCCTG‑3’，Inc–K14R序列为5’‑CCCGCTACACCCTCAACTTC‑3’；Fjav/Rjav为爪哇根结线虫特有引物，所述Fjav序列为5’‑GGTGCGCGATTGAACTGAGC‑3’，Rjav序列为5’‑CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC‑3’；Far/Rar为花生根结线虫特有引物，所述Far序列为5’‑TCGGCGATAGAGGTAAATGAC‑3’，Rar序列为5’‑TCGGCGATAGACACTACAAACT‑3’；用南方根结线虫特有引物Mi‑F/Mi‑R和Inc–K14F/Inc–K14R分别对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，分别得到1条大小为999bp和399bp条带的种群为南方根结线虫；用爪哇根结线虫特有引物Fjav/Rjav对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，得到1条大小为720bp的带的种群为爪哇根结线虫；用花生根结线虫特有引物Far/Rar对经过步骤4确定为根结线虫的待测种群进行进行PCR扩增，并对所得的PCR扩增产物电泳检测，得到1条大小为420bp 的带的种群为花生根结线虫。