[发明专利]一种乙酰胆碱酯酶生物传感器及其应用

摘要

本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶生物传感器及其应用，属于电化学检测技术领域。该生物传感器经如下步骤得到：首先，以KMnO₄、CTAB、PdCl₂、PEG400、H₂PtCl₆、柠檬酸钠和硼氢化钠为起始原料，采用水浴方法制备MnO₂‑nanoflakes纳米复合材料以及Pd‑Pt@MnO₂‑nanoflakes纳米复合材料；其次，用壳聚糖(CS)固定乙酰胆碱酯酶采用物理吸附将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定在Pd‑Pt@MnO₂修饰的玻碳电极表面构建成电化学生物传感器。本发明通过采用电化学与酶传感结合技术，实现了对甲基对硫磷和呋喃丹农药的高灵敏检测，且所需样品少，检测时间短，灵敏度高，低成本，适用于农药残留的分析与检测。

主权项

1.一种乙酰胆碱酯酶生物传感器，其特征在于该乙酰胆碱酯酶生物传感器经由如下步骤得到：（1）Pd‑Pt@ MnO2‑纳米复合材料的制备①MnO2‑纳米材料的制备911mg十六烷基三甲基溴化铵溶于25ml的超纯水中，加热回流至温度保持在140℃时，接着加入KMnO4其质量为79.02mg 溶于25mL的超纯水中 ,待温度恒定保持在140℃时回流8至10分钟，颜色由紫色变为深棕色，冷却至室温，用乙醇洗三次，用水定容至10mL，即得到MnO2‑纳米复合材料；②Pd‑Pt@MnO2‑纳米复合材料的制备取5mL①制得的MnO2‑纳米材料，加入0.5mL 10mM PdCl2，0.5mL 10mM H2PtCl6 , 0.1mL聚乙二醇400和1.0mL 10mM柠檬酸钠搅拌混匀，最后加入3mL 15mM硼氢化钠反应4h，之后用水洗三次离心，定容至5mL，即得到Pd‑Pt@ MnO2‑纳米复合材料；（2）玻碳电极表面预处理将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3糊抛光处理成镜面，依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗，放置于空气中自然干燥，然后在pH 7. 4 的PBS溶液中于+ 1. 75 V恒电位下扫描300s，再于 + 0. 3 V ～ +1. 25 V 和 + 0. 3 V ～ －1. 3 V 之间循环扫描多次，待电流稳定后，用二次水冲洗电极并在空气中自然干燥备用；（3）电化学生物传感界面的构建 取6μL得到的Pd‑Pt@MnO2悬浮液滴涂于预先处理好的玻碳电极表面，放在室温下干燥，即得到Pd‑Pt@MnO2修饰玻碳电极，记为Pd‑Pt@MnO2/GCE；最后待Pd‑Pt@MnO2修饰玻碳电极干后再接着在电极表面滴涂4. 5 μL 乙酰胆碱酯酶和壳聚糖混合物，其中：乙酰胆碱酯酶为3μL和壳聚糖为1.5μL，在4℃环境下干燥过夜，即得到乙酰胆碱酯酶‑壳聚糖 /Pd‑Pt@MnO2/GCE；（4）建立对甲基对硫磷和呋喃丹农药检测的标准曲线把乙酰胆碱酯酶‑壳聚糖/Pd‑Pt@MnO2/GCE作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，测定农药时将工作电极置于含有不同浓度甲基对硫磷和不同浓度呋喃丹的试液中抑制4min用循环伏安扫描多次，待背景电流稳定后，在2mmol/L的巯基乙酰胆碱溶液中25℃下温育10 min，记录它们各自所产生的循环伏安图，电流值随农药的不同浓度呈规律的变化，绘制标准曲线并确定农药的最佳线性范围和检测限；甲基对硫磷农药检测的线性范围为（10‑13）mol/L～（10‑8）mol/L，其检出限为（0.35×10‑13）mol/L；呋喃丹农药检测的线性范围为（10‑12）mol/L～（10‑8）mol/L，其检出限为（0.3×10‑12）mol/L。