[发明专利]与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种与菊花耐涝性显著相关的分子标记及其鉴定方法和应用，包括a.连续两年的耐涝性鉴定；b.菊花品种群体结构及亲缘关系分析；c.关联模型的比较和选择；d.与菊花耐涝性显著关联的分子标记的确定；e.优异等位变异挖掘及亲本选拔。本发明采用盆栽模拟淹水法对100个菊花品种进行连续两年的耐涝性鉴定，采用全基因组关联分析方法检测与耐涝性紧密关联的分子标记位点并进行了优异等位变异的挖掘。本发明检测到4个标记位点与菊花耐涝性显著关联，挖掘了2个优异等位变异并筛选了6份优异菊花品种，这不仅为菊花耐涝性杂交育种工作提供了优异亲本材料也为分子标记辅助育种(MAS)选择提供了一定参考。

主权项

1.一种鉴定与菊花耐涝性显著相关分子标记的方法，其特征在于包括以下步骤：a、耐涝性鉴定：选取多份不同来源且无直接亲缘关系的菊花品种，分别连续两年进行耐涝性鉴定，试验采用完全随机区组设计，设处理和对照，处理组10‑12叶龄苗时进行涝处理，对照组植株正常管理；淹水3d后记录萎蔫指数，8d后根据淹水后叶色，叶形，茎色及茎形进行打分并统计死叶率；萎蔫指数分级标准为：1级：植株挺直，叶片自然伸展；2级：植株基本挺直，最下层叶片发软下垂，中上层叶片均自然伸展；3级：植株顶端稍有萎蔫弯曲，中下层叶片出现下垂；4级：植株顶端萎蔫弯曲，所有叶片均出现不同程度的下垂；5级：植株萎蔫严重，所有叶片皱缩明显；采用隶属函数法求出每个指标的隶属函数值，计算公式为：若该指标数据与耐涝性是正相关关系，则X_i＝(X‑X_min)÷(X_max‑X_min)；若该指标数据与耐涝性是负相关关系，则X_i＝1‑(X‑X_min)÷(X_max‑X_min)；其中，X为某个品种某个指标的测定值，X_min和X_max为所有品种该指标的最小值和最大值；用各个品种所有指标的隶属函数值的平均值大小来评价该品种的耐涝性，平均隶属函数值越大，其耐涝性越强；b、菊花品种群体结构和亲缘关系分析：1)利用分子标记数据采用STRUCTURE软件对菊花品种群体进行类群划分，计算各个品种的Q值即某个品种的基因组变异源于某个群体的概率得到Q‑矩阵，并绘制出群体结构图；2)采用TASSEL软件对该群体进行主成分分析，将累积解释率达到25％的前几个主成分构建PC‑矩阵并用于后续关联分析；3)根据三种标记SRAP位点、SCoT位点及EST‑SSR位点的整合数据采用SPAGeDi软件分析品种间的亲缘关系，得到亲缘关系系数K‑矩阵；c、关联模型的比较和选择：将步骤b中所得到的Q‑矩阵、PC‑矩阵及K‑矩阵作为/不作为协变量构建了6种关联分析模型：3种一般线性模型包括GLM，GLM+Q和GLM+PC及3种混合线性模型包括MLM，MLM+Q和MLM+PC；结合分子和表型数据在TASSEL中绘制Q‑Q图并根据观察–log P值与期望–log P值的偏离程度大小选择最优模型，其中偏离程度越小，模型越能控制Ⅰ类错误和Ⅱ类错误；d、与菊花耐涝性紧密关联的分子标记的确定：根据步骤c中选择的最优模型应用TASSLE软件对两年重复试验得到的表型数据结合分子标记数据分别进行关联分析；以两年数据的关联分析都能检测到的显著标记位点P<0.01为与菊花耐涝性紧密关联的分子标记，同时得出该标记位点的表型变异解释率R²；步骤b中运用STRUCTURE软件中的Bayesian方法对菊花品种群体进行基于数学模型的类群划分，先假设群体数目K为1‑15，将MCMC开始时的不作数迭代设为10000次，并假定位点都是独立的，每个K值独立运算5次，然后根据似然函数值最大的原则和ΔK值来确定合适的K值并绘制散点曲线图，根据K值的取值确定多个菊花品种的类群划分，将100份菊花品种材料分为两个亚群，其中Pop1包括63份材料，Pop2包括37份材料，其中有12份材料由于其在某一亚群的概率小于0.6，划为混合群；主成分分析发现前7个主成分累积解释率达到25.38％，故采用PC₇‑矩阵作为模型选择及关联分析的协变量；亲缘关系分析发现该群体的亲缘关系系数在0‑0.588之间，平均值为0.034，其中74.57％的亲缘关系系数小于0.05，而只有1.19％的亲缘关系系数大于0.25，说明该群体遗传多样性高且无明显的亲缘关系，适合进行关联分析。