[发明专利]一种固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠的提取方法

摘要

本发明公开了一种固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠的提取方法，属于生物工程技术领域。本发明用纳米二氧化硅负载胰蛋白酶，制得固定化胰蛋白酶酶解猪小肠黏膜液，再将酶解液经树脂吸附，再用氯化钠溶液洗脱解吸附，收集吸附液用超滤膜过滤分离，经乙醇沉淀、干燥一步纯化制得精品肝素钠。本发明利用固定化酶酶解猪小肠，且固定化胰蛋白酶方便回收，因无需高温灭酶，不会转变为杂质影响纯化工艺，又利用D﹣254型树脂可以吸附粗品肝素钠中杂质，提高了除杂率，解决了传统肝素钠提取率低、得率低和性质不稳定等问题，本发明提取的肝素钠纯度较高，性质稳定，操作过程简单，生产成本较低，适合大规模生产。

主权项

一种固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠的提取方法，其特征在于具体制备步骤为：（1）称取0.2~0.3g胰蛋白酶，加入100~120mL去离子水中，以400~500r/min搅拌15~20min，加入5.0~7.5g纳米二氧化硅，继续搅拌2~3h，转入离心机中离心分离，取沉淀，得固定化胰蛋白酶，备用；（2）称取300~500g新鲜猪小肠，用去离子水洗涤干净，切开，并用刮刀刮取小肠内壁黏膜，收集小肠内壁黏膜，加入200~300mL质量分数为3%氯化钠溶液中，并用匀浆机匀浆20~30min，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至7.0~7.5，加热煮沸15~20min，待温度冷却至50~55℃，加入0.2~0.3g固定化胰蛋白酶，用质量分数为1%氢氧化钠溶液调节pH至8.5~9.0，保持温度酶解4~5h，将混合液置于4000~5000r/min离心机中，在4~5℃下离心分离，清洗沉淀回收固定化胰蛋白酶，收集上清液，得猪小肠酶解液；（3）向上述猪小肠酶解液中，加入1.2~1.8g D﹣254型树脂，在室温下以50~60r/min搅拌8~10h，静置30~40min，过滤，用去离子水和质量分数为5%氯化钠溶液洗涤树脂2~3次，再将树脂浸泡在8~12mL质量分数为20%氯化钠溶液中，以100~200r/min搅拌洗脱2~3次，每次3~4h，合并洗脱液，将洗脱液用膜通量为3000~4000的超滤膜过滤浓缩至原溶液体积的15~20%，收集截留液，加入30~50mL质量分数为95%乙醇溶液，静置10~12h，过滤，将沉淀置于真空干燥箱中干燥5~6h，得固定化酶酶解猪小肠精品肝素钠。