[发明专利]一种利用氧化石墨烯-金属离子配位固定化酶的方法

摘要

本发明公开了一种利用氧化石墨烯‑金属离子配位固定化酶的方法，属于固定化酶技术领域。在固定化过程中，过渡态金属离子可以与氧化石墨烯的羧基配位，并通过配位作用固定化甲酸脱氢酶。片层结构的氧化石墨烯是一种优良的固定化载体，表面带有环氧基、羰基、羧基等功能性基团，负载面积大。利用金属离子的配位作用，不仅可使氧化石墨烯均匀分散，增大酶的负载量，并且通过与酶组氨酸标签的配位相互作用，实现酶在石墨烯上的固定化。本发明的优点在于工艺简单、制备条件温和、固定化率高。所得固定化酶的温度稳定性、pH稳定和和重复使用稳定性明显增强，同时具有较高的酶活性回收率。

主权项

1.一种利用氧化石墨烯‑金属离子配位固定化酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)粗酶液制备：将可表达带His‑tag标签的目标酶的重组表达菌株接种培养，培养一段时间后加入乳糖诱导剂IPTG；培养所得菌液，离心获取细胞，配制成细胞悬液；超声破碎并离心，收集上清液即为含有带His‑tag标签的目标酶的粗酶液；所述目标酶为甲酸脱氢酶；2)纯酶的制备：采用镍柱对步骤1)得到的粗酶液进行纯化并除盐，得到带His‑tag标签的目标酶；3)氧化石墨烯溶液的制备：将氧化石墨烯溶解在纯水中，超声分散后得到浓度为0.1～10mg/mL的分散均匀的氧化石墨烯悬浊液，离心之后取上清液即为氧化石墨烯溶液；4)氧化石墨烯‑金属离子配位固定化载体的制备：选用对游离目标酶酶活无明显抑制作用的金属离子，所述金属离子选自Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Sr²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Ba²⁺；加入至步骤3)得到的氧化石墨烯溶液中并使金属离子在溶液中配位平衡后的终浓度为0.1～10mM，4～35℃恒温振荡1～5h，即得到氧化石墨烯‑金属离子配位固定化载体的悬浊液；5)固定化酶的制备：在步骤4)得到的氧化石墨烯‑金属离子配位固定化载体的悬浊液中加入步骤2)得到的带His‑tag标签的目标酶的酶溶液，并使目标酶的终浓度为0.1～10mg/mL，4～35℃恒温振荡1～5h，离心，洗涤，重悬，即得氧化石墨烯‑金属离子配位固定化酶。