[发明专利]一种包含4-1BB的慢病毒制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种包含4‑1BB的慢病毒制备方法及应用。通过所述慢病毒制备方法制备的慢病毒，可以不需要添加CD28，仅在转染前，于培养基中直接添加少量的CD3作为T细胞激活第一信号，减少Car‑T细胞制备的程序，降低成本及污染风险；通过重组VSVG，刺激T细胞进一步活化，增加病毒与细胞接触概率以有效提高感染效率。

主权项

一种包含4‑1BB的慢病毒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、慢病毒载体质粒881‑3‑SJ19的构建：A1、对CD19CAR基因进行PCR扩增：以全基因合成CD19CAR基因为模板，进行PCR扩增，得到CD19CAR扩增产物；A2、凝胶提纯CD19CAR扩增产物：使用凝胶提纯PCR扩增产物中CD19CAR的cDNA；A3、用CD19CAR基因转染细胞：将步骤A2中得到的CD19CAR的cDNA、18‑T Vector和Solution I混合均匀，在16℃下保存16小时；然后加入Trans5α感受态细胞中，依次在冰中保持30min，然后加热至42℃保持45s，再在冰中保持1min，然后加入SOC/LB培养基，在37℃振荡培养60分钟，培养后离心，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在含有Amp的琼脂平板培养基上培养；A4、提取含有CD19CAR基因的质粒：从琼脂平板培养基上挑取881‑3‑SJ19质粒；B、VSVG质粒的改造：B1、对4‑1BB基因进行PCR扩增：以全基因合成4‑1BB的基因片段为模板，进行PCR扩增，得到4‑1BB扩增产物；B2、对VSVG基因进行PCR扩增：以全基因合成VSVG的基因片段为模板，进行PCR扩增，得到VSVG扩增产物；B3、获得4‑1BB‑VSVG重组基因片段：将所述4‑1BB扩增产物和VSVG扩增产物进行酶切，并回收酶切产物进行连接反应，得到连接产物；B4、用4‑1BB‑VSVG重组基因片段转染细胞：将步骤B3得到的连接产物加入TOP10感受态细胞中，混合均匀后依次在冰中保持30min，然后加热至42℃保持45s，再在冰中保持1min，然后加入SOC/LB培养基，在37℃振荡培养60分钟，培养后离心，弃部分上清液后，将剩余液体涂布在琼脂平板培养基上培养；B5、改造VSVG质粒的提取：用碱裂解法或质粒抽提试剂盒提取改造的VSVG质粒，命名为4‑1BB‑VSVG质粒；C、慢病毒的制备：C1、配制BES溶液：将10ml 1.4M的NaCl、5ml 0.5M的BES、500μL 150mM的Na ₂HPO₄和1100μL 1M的NaOH混合均匀、加双蒸水定容至50ml、调PH至6.95，过滤后保存，即为BES溶液；C2、配制转染试剂：将步骤A4得到的881‑3‑SJ19质粒、NRF质粒、步骤B5得到的4‑1BB‑VSVG质粒、1M CaCl₂和双蒸水，混合均匀后，逐滴加入步骤C1得到的BES溶液，滴加完毕后，静置30min；即得转染试剂；C3、细胞转染和培养：复苏293T细胞并进行培养，当所述293T细胞密度达到培养皿底部70％时进行转染，用不含血清的DMEM培养基对所述293T细胞进行换液；换液后，逐滴加入步骤C2得到的转染试剂，混合均匀后，将所述293T细胞放入培养箱，静置2小时，静止后滴加胎牛血清，继续培养8小时，然后使用含10wt％胎牛血清的DMEM换液，继续培养48小时；C4、病毒收集：步骤C3完成后，收集上清液，离心过滤后，即得病毒原液。