[发明专利]CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法

摘要

本发明提供一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，通过根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；然后环状空质粒酶切后，酶切片段连接PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒。

主权项

1.CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括如下：（1）干扰序列设计：根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；所述各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链序列如下：shRNA1‑Top：gatccGGATCAGCATCGACTCCTTTTCAAGAGAAAGGAGTCGATGCTGATCCTTTTTTg，shRNA1‑Bottom：aattcAAAAAAGGATCAGCATCGACTCCTTTCTCTTGAAAAGGAGTCGATGCTGATCCg；及shRNA2‑ Top：gatccGGATCAGTATATACACTTCTTCAAGAGAGAAGTGTATATACTGATCCTTTTTTg，shRNA2‑ Bottom：aattcAAAAAAGGATCAGTATATACACTTCTCTCTTGAAGAAGTGTATATACTGATCCg；及shRNA3‑Top：gatccGCAAGGCAGTCCATGTCATTTCAAGAGAATGACATGGACTGCCTTGCTTTTTTg，shRNA3‑Bottom：aattcAAAAAAGCAAGGCAGTCCATGTCATTCTCTTGAAATGACATGGACTGCCTTGCg；（2）慢病毒表达载体的构建及鉴定：空载体pGC‑LV 带有 GFP标记，将PLVX‑shRNA‑PURO vector环状空质粒，用BamH和EcoR 限制性内切酶进行双酶切，并回收PLVX‑SHRNA‑PURO vector酶切片段，连接空PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒pLVX‑CXCR4shRNA；（3）QPCR筛选shRNA：CXCR4基因的QPCR引物为载体多克隆位点两端的引物，培养293细胞，将获得的质粒pLVX‑CXCR4shRNA和lipo2000复合物加入六孔板293细胞中，提取各组细胞的RNA，将RNA反转录为cDNA，利用cDNA为模板，利用所述QPCR引物检测CXCR4基因的相对表达量，荧光定量检测各组引物；PCR反应条件：95℃30s，1循环，55℃30s40循环，95℃5s，60℃1min，95℃15s。