[发明专利]一种基于Hg2+辅助及双聚合酶等温核酸扩增技术的microRNA检测方法

摘要

本发明公开了一种基于Hg²⁺辅助及双聚合酶等温核酸扩增技术的microRNA检测方法，属于光学生物传感技术领域。基于聚合酶Klenow片段和末端脱氧核苷酸转移酶共同催化作用，将microRNA有效延伸成长度较长的聚胸腺嘧啶碱基序列，加入Hg²⁺后形成T‑Hg²⁺‑T双链结构，SYBR Green І荧光染料插入到T‑Hg²⁺‑T双链结构中使SYBR Green І的荧光增强，荧光增强的程度与microRNA的浓度呈正相关，据此实现microRNA的灵敏检测。

主权项

1.一种基于Hg²⁺辅助及双聚合酶等温核酸扩增技术的microRNA检测方法，其特征在于，步骤如下：(1)将microRNA与模板DNA混合，80℃退火杂交5min后慢慢冷却至室温，加入含聚合酶Klenow片段、脱氧三磷酸胸腺嘧啶核苷和末端脱氧核苷酸转移酶的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液，在37℃水浴中反应3h，制成聚胸腺嘧啶碱基序列，加入Hg²⁺并完全混合后，在37℃水浴中等温反应1h，形成T‑Hg²⁺‑T双链结构溶液；所述的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液的浓度为20mM，pH 7.9，含50mM KAc、10mM Mg(Ac)₂和0.25mM CoCl₂；(2)将SYBR GreenI加入步骤(1)反应形成的T‑Hg²⁺‑T双链结构溶液中，混合后移入离心管中，用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液稀释至200μL，室温下反应10min，在光程为1cm的石英池中，激发波长为490nm和扫描范围为510‑650nm时，采用荧光光谱仪测量发射波长为525nm处的荧光。