[发明专利]一种地衣芽孢杆菌菌种筛选方法

摘要

一种地衣芽孢杆菌菌种筛选方法，采用的点种方法，只用进行1轮筛选，约16天，就可完成200株菌株的筛选。且筛选过程目的导向性强，前期点种进行大量筛选，减少后期摇瓶筛选的工作量，较传统筛选方法，工作量减少3/4，周期缩短3/4的时间，效率是传统筛选方法的4倍；而且筛选工作量小、目的性强、操作简单、误差小，不存在先培养单菌落再打块引起一系列的问题。

主权项

 一种地衣芽孢杆菌菌种筛选方法：步骤如下：步骤一、制备地衣芽孢杆菌新鲜菌种，将保存的地衣芽孢杆菌甘油管传1号斜面培养基，30℃‑37℃培养3‑7天；所述1号斜面培养基配方为：葡萄糖：1%，酵母浸粉：0.5%，蛋白胨：0.5%，牛肉膏：0.3%，NaCl：0.5%，CaCl₂：0.05%， Na₂HPO₄：0.05%，可溶性淀粉：1%，(NH₄)₂SO₄：0.05%，MnSO₄：0.0005%，Na₂MoO₄：0.0005%，余量为水，补足100%；PH为6.5‑7.2；步骤二、将步骤一制备的地衣芽孢杆菌新鲜菌种1cm²无菌条件下稀释分单涂平板培养基，30℃‑37℃培养48‑72h，得平板培养基地衣芽孢杆菌新鲜菌种；所述平板培养基配方为：鱼粉蛋白胨：0.5%，NaCl：0.5%，牛肉膏：0.3%，琼脂：1.5%，余量为水，补足100%；PH为6.5‑7.2；步骤三、发酵培养基琼脂块平板备选菌种的制备步骤四、制备初筛斜面菌苔（1）鉴定平板的制备，分为上下两层，下层：吸取20ml 1号营养琼脂培养基中到培养皿中铺平作为下层；上层：洗取一支18×180斜面的金黄色葡萄球菌到20ml带珠子瓶的无菌水中打碎，摇匀；吸取1.5ml到100ml 2号营养琼脂培养基中，摇匀；吸5ml到下层培养基上，快速铺平；制得鉴定平板；所述的1号营养琼脂培养基配方为：鱼粉蛋白胨：0.5%，NaCl：0.5%，牛肉膏：0.3%，琼脂：1.5%，余量为水，补足100%；PH为6.5‑7.2；所述的2号营养琼脂培养基配方为：鱼粉蛋白胨：0.5%，NaCl：0.5%，牛肉膏：0.3%，琼脂0.9%，余量为水，补足100%；PH为6.5‑7.2；（2）将步骤三得到的发酵培养基琼脂块平板备选菌种，用镊子移至鉴定平板，每个鉴定平板放置4块，37℃培养18h，测量抑菌圈大小；选取抑菌圈直径在26mm‑28mm的单菌落传2号斜面培养基40支，30‑37℃培养3‑5天，得初筛斜面菌苔，4℃冰箱保存备用；所述2号斜面培养基配方为：葡萄糖：1%，酵母浸粉：0.5%，蛋白胨：0.5%，牛肉膏：0.3%，NaCl：0.5%，CaCl₂：0.05%， Na₂HPO₄：0.05%，可溶性淀粉：1%，(NH₄)₂SO₄：0.05%，MnSO₄：0.0005%，Na₂MoO₄：0.0005%，余量为水，补足100%；PH为6.5‑7.2；步骤五、制备地衣芽孢杆菌菌种（1）制备种子菌取步骤四初筛斜面菌苔，接种到种子摇瓶，接种量：1cm²新鲜斜面菌苔/100ml，培养18‑24h，培养温度：30‑37℃，摇床转速：180r/mim，得种子菌；所述种子摇瓶配方为：葡萄糖：2%，豆饼粉：2%，K₂HPO₄：0.2%，酵母浸粉： 1%，MgSO₄：0.05%，蛋白胨：0.2%，蔗糖：0.8%，玉米浆：2%，尿素：0.2%，工业盐：0.1%，轻质碳酸钙：0.2%，余量为水，补足100%；PH为6.5‑7.2；（2）制备地衣芽孢杆菌菌种将种子菌转接发酵摇瓶，接种量：每发酵摇瓶5ml/50ml，周期：48‑72h，培养温度：30‑37℃，摇床转速：180r/mim，得地衣芽孢杆菌发酵液；所述发酵摇瓶配方为：葡萄糖：4%，豆饼粉：1.5%，玉米粉：2%，花生饼粉：1%，棉籽饼粉：1%，玉米浆：0.5%，酵母浸粉：0.5%，蛋白胨：0.5%，工业盐：0.1%，轻质碳酸钙：0.2%，余量为水，补足100%，PH为6.5‑7.2；地衣芽孢杆菌菌种检测：①活菌数：采用血球计数法，吸取1ml发酵液稀释1000倍进行血球计数；② 抑菌能力检测：鉴定平板的制备：鉴定平板分为上下两层，下层：吸取20ml营养琼脂培养基中到培养皿中铺平作为下层；上层：洗取一支18×180斜面的金黄色葡萄球菌到20ml珠子瓶中打碎，摇匀；吸取1.5ml到100ml上层营养琼脂培养基中，摇匀；吸5ml到下层培养基上，快速铺平，制得鉴定平板；检测：每个鉴定平板上对应的放置4个牛津杯，编号，吸取200μl离心的地衣芽孢杆菌发酵液上层清液，小心加入到牛津杯中，37℃培养18h后检测抑菌圈；以活菌数超过90亿/ml及抑菌圈大于26mm为标准，筛选出地衣芽孢杆菌菌种；其特征是：所述步骤三、发酵培养基琼脂块平板备选菌种的制备方法是：（1）发酵培养基琼脂块平板制备：① 配制发酵琼脂平板，所述发酵琼脂平板配方为：琼脂：1.5%，葡萄糖：4%，豆饼粉：1.5%，玉米粉：2%，花生饼粉：1%，棉籽饼粉：1%，玉米浆：0.5%，酵母浸粉：0.5%，蛋白胨：0.5%，工业盐：0.1%，轻质碳酸钙：0.2%，余量为水，补足100%；PH为6.5‑7.2；② 配制水琼脂平板，所述水琼脂平板配方为：琼脂粉：1.5%，余量为水，补足100%；③在发酵琼脂平板上打块，用镊子夹取小块放置到水琼脂平板上打块，制得发酵培养基琼脂块平板；（2）从步骤二制备的平板培养基地衣芽孢杆菌新鲜菌种挑取100‑200个单菌落在发酵培养基琼脂块平板上点种，30℃‑37℃进行培养48‑72h，得发酵培养基琼脂块平板备选菌种。