[发明专利]基于石蜡切片和苯胺蓝荧光染色法观察匍匐翦股颖叶片组织胼胝质的沉积的方法

摘要

本发明公开了一种基于石蜡切片和苯胺蓝荧光染色法观察匍匐翦股颖叶片组织胼胝质沉积的方法，包括如下步骤：S1、药品配制；S2、实验方法依次经取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、烘片、染色和封片流程制作石蜡切片；经荧光染色剂染色后置于荧光显微镜下观察并拍照。本发明首次利用石蜡切片和苯胺蓝荧光染色法观察匍匐翦股颖叶片组织胼胝质的沉积，极大的缩短了匍匐剪股颖石蜡制片的实验时间，克服了匍匐翦股颖叶片小而细的制片难度，突破了材料本身、环境因素所带来的限制，可快速高效的完成石蜡制片过程，并最终获得优良的胼胝质的荧光显微观察结果。

主权项

基于石蜡切片和苯胺蓝荧光染色法观察匍匐翦股颖叶片组织胼胝质的沉积方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、药品的配制；S11、将福尔马林10ml、乙酸3ml、50％的乙醇87ml、5ml甘油混合均匀，得FAA固定液；S12、将无水乙醇与二甲苯以1∶1的比例混合配制成1/2二甲苯；S13、称取0.1g水溶性苯胺蓝溶解于100ml浓度为0.07mol/L，pH＝7的磷酸缓冲液中，得0.1％的苯胺蓝荧光染色剂。S2、制作石蜡切片；S21、用锋利的刀片快速取下宽度约0.8mm的匍匐剪股颖叶片，将叶片切割成长度约5mm左右的小段，放入青霉素小瓶中，加入步骤S11所得的FAA固定液，固定12h；S22、经FAA固定后，依次置换15％、30％、50％、70％、85％的乙醇中进行梯度脱水，各脱水20min，于95％乙醇中脱水30mim，无水乙醇中脱水两次，各20min；然后依次置换1/2二甲苯、二甲苯进行透明，于1/2二甲苯中透明1h，二甲苯中透明两次，每次30min，直至材料完全透明为止；S23、在装有所得透明材料的青霉素小瓶中加碎蜡两次，第一次加入与瓶中二甲苯等量的碎蜡，放入电热鼓风干燥箱中温度36℃保持1h至所加碎蜡完全融化后，加入瓶中液体一半的碎蜡，放入电热鼓风干燥箱中调节温度至36℃过夜后，调节温度至42℃，置换50％石蜡保持1h后，温度调至50℃，置换75％的石蜡保持30min后，调节温度至60℃，依次置换纯石蜡A、纯石蜡B、纯石蜡C各30min，TKY‑BMB型石蜡包埋机进行包埋，一个蜡块中一个材料，蜡块的尺寸为：0.5cm×0.5cm×0.5cm，将包埋好的蜡块冷却后直接修块，进行切片或保存到4℃冰箱备用；S24、采用轮式手动切片机进行连续切片，厚度10μm；将HH‑6数显恒温水浴锅温度调节至45℃，在500ml大烧杯加入蒸馏水放入水浴锅中，将切好的蜡带光面朝下放入烧杯中，待蜡带完全展开后，将涂抹好蛋清甘油的载玻片伸入烧杯中，使蜡带粘到载玻片上，将粘有蜡带的载玻片自然晾干后，在光学显微镜下观察展片效果，取展片效果好的片子置于电热鼓风干燥箱中于38℃下烘烤，直到片子完全干燥；S25、取干燥的片子，依次放到分别加有二甲苯、1/2二甲苯、95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇、30％的乙醇、磷酸缓冲液、0.1％的苯胺蓝染色剂的立式染缸中；在二甲苯、1/2二甲苯中各5min，95％的乙醇、85％的乙醇、70％的乙醇、50％的乙醇、30％的乙醇中各5S，磷酸缓冲液中10min，0.1％的苯胺蓝染色剂中30min；然后将染色后的片子取出，置于蒸馏水中30S，洗净片子上的杂质后，过1/2二甲苯、二甲苯各10S，待片子干燥后采用中性树胶封片；S26、将所得的片子自然风干后，置于LeiCaDM6000B荧光显微镜下观察并拍照。