[发明专利]基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法

摘要

基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，包括：步骤1，选用6‑7周龄大鼠，收集处死后大鼠的肾脏，剪除结缔组织，取肾皮质剪碎成50‑100mg组织小块，采用液氮速冻并保存于‑80℃冰箱中；步骤2，采用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；步骤3，用核酸定量仪测量基因组DNA的浓度和纯度，通过0.5％‑1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，并将检测合格的DNA样本置于‑20℃至‑80℃的冰箱备用；步骤4，采用甲基化转化试剂盒修饰基因组DNA，用核酸定量仪确定修饰好的基因组DNA浓度；步骤5，在多种不同的实验条件下进行PCR扩增；步骤6，从步骤5中选定后续步骤所用的样本。本发明提高了钙黏蛋白甲基化实验的成功率。

主权项

一种基于亚硫酸氢盐测序法的钙黏蛋白甲基化检测方法，其特征在于，包括：步骤1，选用SPF级6‑7周龄大鼠，将其处死后收获肾脏，迅速收集处死后大鼠的肾脏，剪除结缔组织，取肾皮质剪碎成50‑100mg组织小块，采用液氮速冻并保存于‑80℃冰箱中；步骤2，采用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；步骤3，用核酸定量仪检测基因组DNA的浓度和纯度，通过0.5％‑1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，并将检测合格的基因组DNA样本置于‑20℃至‑80℃的冰箱中备用；步骤4，采用甲基化转化试剂盒修饰基因组DNA，用核酸定量仪检测修饰好的基因组DNA浓度和纯度，再将其置于‑20℃冰箱备用；步骤5，在多种不同的实验条件下进行PCR扩增，通过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，凝胶成像系统观察、拍照，并将回收完毕的目的PCR产物置于4℃备用；上述不同的实验条件是指保持引物序列及其它组分终浓度均不变、但改变转化后基因组DNA和Mg²⁺的终浓度；步骤6，根据5的拍照结果选定后续步骤所用的样本；步骤7，采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收步骤6中的样本，通过载体连接将其转化入Trans1‑T1感受态细菌中，行蓝白克隆筛选，并通过通用引物做PCR扩增，产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察、拍照，以确认阳性克隆；步骤8，选取步骤7中阳性克隆斑中的菌体，在37℃恒温震荡培养8‑12h后，取变浑浊的样本进行测序。