[发明专利]羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法

摘要

本发明涉及一种羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法，其是通过普通PCR对掺假模型进行分级，利用荧光定量PCR获得处于各个相应等级的Ct值与掺假比例的关系式，之后通过普通PCR确定待检样品的等级，然后对待检样品进行荧光定量PCR获取Ct值，代入到相应级别的关系方程中从而计算出羊奶粉中牛奶成分的百分含量，本发明将普通PCR与实时荧光定量PCR相结合，能够完成羊奶粉中牛奶成分的定性、粗放与精准定量检测，步步深入，成本逐渐增加，可用于不同层次的需求，其灵敏度更高、特异性更强，且检出限更低，本发明方法可推广用于所有动物粉制剂中的掺假检测，也可被其他动物性产品中动物源成分的检测作为借鉴。

主权项

1.一种羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法，其特征在于由以下步骤组成：(1)准确配制牛奶粉含量分别为0.1％、0.5％、1％、5％、10％、30％、50％、70％和90％的羊奶粉作为9个标准样品；(2)向步骤(1)配制的9个标准样品中分别加入双蒸水，固液比为1:5～15mL/g，均匀，分别提取9个标准奶液的DNA并标准化为50ng/μL，获得9个标准DNA样品；(3)对9个标准DNA样品进行普通PCR扩增，获取9个标准DNA的琼脂糖凝胶电泳图，利用Quantity One软件计算出9个标准DNA的电泳条带密度值，根据标准DNA的电泳条带亮度将9个标准样品归类为7个等级：无掺假、极低、低、中、高、极高、完全掺假，其中各等级对应的条带密度值M为：条带密度值上述的普通PCR扩增为：上、下游引物各0.6μL，DNA模板2μL，2×Es Taq Master mix 6.8μL以及双蒸水10μL；上游引物的序列为：F:5’‑CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA‑3’,下游引物的序列为：R:5’‑AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT‑3’；反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；(4)将步骤(3)剩余的9个标准DNA样品，根据普通PCR扩增所得的粗放等级结果，对各标准DNA样品进行荧光定量PCR扩增，并获取对应的Ct值，从而建立粗放定量所获得极低至极高之间的等级的标准样品中牛奶成分百分含量W与Ct值之间的关系式：上述的荧光定量PCR的反应体系为：上、下游引物各0.4μL，DNA模板1μL，2×Ultal SYBR Mixture 5μL以及双蒸水3.2μL；上游引物的序列为：F:5’‑CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA‑3’,下游引物的序列为：R:5’‑AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT‑3’；反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环；(5)取待检奶粉样品，按照步骤(2)的操作提取待检样品的DNA并标准化为50ng/μL；(6)将标准化后的待检样品按照步骤(3)的操作进行普通PCR检测，利用Quantity One软件计算出待检样品条带的密度值，并粗放定量待检样品中牛奶成分的掺假级别，若掺假级别处于无掺假或完全掺假等级，则结束操作；否则，进行下一步；(7)将待检样品按照步骤(4)的操作进行实时荧光定量PCR检测，获取待检样品对应的Ct值，根据步骤(3)判断的掺假级别将Ct值带入到步骤(4)相应级别的关系式中，从而计算出待检样品中牛奶成分的百分含量。