[发明专利]一种破膜制备原生动物单细胞扫描电镜样品的方法

摘要

一种破膜制备原生动物单细胞扫描电镜样品的方法，是要解决现有的方法制备的原生动物单细胞扫描电镜样品结果不稳定，常会出现细胞器的丢失，细胞内部结构的损坏，观察到的结果仅限于紧贴表膜下的结构，而无法观察到细胞质内结构的问题。方法：一、取材和清洗；二、固定及破膜；三、水洗；四、脱水；五、CO₂临界点干燥；六、粘台；七、喷金；八、电镜观察。本方法步骤简化，操作简便，可以观察到更为全面和细致的细胞内结构，可达到90％以上成功率。本发明用于破膜制备原生动物单细胞扫描电镜样品。

主权项

1.一种破膜制备原生动物单细胞扫描电镜样品的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、取材和清洗实验前一天对原生动物进行低温或饥饿处理，于第二天挑取140～160只形态正常且原生质均匀的原生动物到干净的凹面皿中，用纯净水对原生动物体进行冲洗以将原生动物体表面附着的污物清洗干净，然后将凹面皿中水吸出，水留的尽量少；二、固定及破膜将固定破膜剂注入到固定缸中，用微吸管将凹面皿中的原生动物体吸取注入到固定缸中，于4℃冰箱避光固定及破膜10～15min；三、水洗将已经破膜并固定后的原生动物体用重蒸水水洗5～6次，使细胞中未被固定的细胞质流出，且要保证细胞结构的完整性；四、脱水对于水洗后的原生动物体，依次用体积浓度为30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％的乙醇进行梯度脱水，每次10min，其中100％的乙醇重复脱水3次，在最后一次100％乙醇脱水时用微吸管将原生动物体转移到干燥装置上；五、CO2临界点干燥然后将载有原生动物体的干燥装置用临界点干燥仪进行临界点干燥，干燥时间为2‑3h，温度为8‑10℃；六、粘台在无风、干燥的实验室内，于体视解剖镜下将干燥装置内干燥好的原生动物用睫毛笔逐个粘到样品台导电胶上；七、喷金用真空离子溅射仪对样品进行喷金，离子化电流强度为40mA，喷金时间为170s；八、电镜观察将制备好的扫描电镜样品用扫描电子显微镜观察拍照，强度为5kv，10μA Mix探头；步骤二所述固定破膜剂是由质量浓度为4％的高锰酸钾和重蒸水组成的混合物，不同的原生动物的固定破膜剂的具体配比如下：前口虫：4％高锰酸钾:重蒸水＝1:11(v/v)尾柱虫：4％高锰酸钾:重蒸水＝1:10(v/v)浮萍棘尾虫：4％高锰酸钾:重蒸水＝1:14(v/v)贻贝棘尾虫：4％高锰酸钾:重蒸水＝1:14(v/v)扇形游仆虫：4％高锰酸钾:重蒸水＝1:12(v/v)；步骤四所述干燥装置包括顶盖(1)、底部(2)和侧壁(3)，为圆柱型，底部(2)是网孔大小为10‑20μm的筛绢，底部(2)直径为1cm，侧壁(3)高度为1cm，所述顶盖(1)与侧壁(3)之间采用螺纹连接。