[发明专利]表达高致病性禽流感H5N1血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌

摘要

本发明涉及表达高致病性禽流感(AIV)H5N1血凝素HA蛋白的重组枯草芽孢杆菌(B.S.‑HA)，属于生物技术基因工程领域。本发明成功构建了高致病性禽流感血凝素HA蛋白重组枯草芽孢杆菌表达质粒pHT43，并成功电击转化入枯草芽孢杆菌WB800N菌株(B.S.)。经Western‑blot验证高致病性禽流感血凝素HA蛋白在重组枯草芽孢杆菌内可以被成功表达。口服免疫可以刺激10日龄雏鸡机体产生有效的AIV特异性免疫应答水平。重组枯草芽孢杆菌(B.S.‑HA)有望开发成预防高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

主权项

一种高致病性禽流感血凝素HA蛋白的整合表达质粒pHT43‑HA，是由以下方法构建而成：1.1高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因的克隆：参照已发表的高致病性禽流感的血凝素HA序列(GenBank登陆号：KP019932.1)，设计一对扩增HA蛋白基因的引物，并在上、下游引物5’端分别引入BamHI、SmaI酶切位点(下划线为酶切位点)，引物序列如下：P1：CGGATCCACCATGGAAACAACTCGP2：GCCCGGGTTAAATGCAAATTCTGC以pMD19‑HA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩增HA蛋白基因，PCR反应体系均为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，69℃30sec，72℃1min，30cycles，72℃10min，4℃10min。将PCR产物用T4连接酶连接到pMD19‑T载体上，构建的载体分别命名为T‑HA。测序后获得具有高致病性禽流感的血凝素HA的DNA序列。1.2重组表达载体pHT43‑HA的构建将T‑HA质粒利用限制性核酸内切酶BamHI、SmaI进行酶切得到高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因并用T4连接酶克隆至载体pHT43上，获得表达载体pHT43‑HA。1.3重组表达载体pHT43‑HA的验证采用限制性核酸内切酶BamHI、SmaI，用双酶切验证重组表达载体pHT43‑HA。如图2可知：1为表达载体pHT43‑HA经BamHI、SmaI酶切得到1600bp高致病性禽流感血凝素HA蛋白基因。