[发明专利]十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法

摘要

本发明涉及一种十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法，该方法包括以下步骤：⑴使用改良的CTAB法提取三个相互之间地理间隔超过300 km的黄绿卷毛菌居群的基因组DNA；⑵从三个居群中各随机选取一个个体的基因组DNA混合，检测总DNA的质量，并制备基因文库，经库检合格后，进行Illumina HiSeq^TM2500测序；⑶测序数据拼接完成后，使用SR search 软件检测总DNA序列中简单重复序列SSR并运用primer3进行引物设计；⑷采用温度梯度法获得退火温度为50~60℃的SSR引物；⑸利用SSR引物对三个居群的黄绿卷毛菌基因组DNA分别进行PCR扩增，并进行测序、验证，获得具有多态性的12对引物；⑹计算等位基因数N_a、单倍型多样性H_d遗传分化系数F_ST、核苷酸多样性P_i、G_ST以及π值。本发明有利于大规模的研究。

主权项

十二对黄绿卷毛菌微卫星引物的设计、扩增与测序方法，包括以下步骤：⑴使用改良的CTAB法提取三个相互之间地理间隔超过300 km的黄绿卷毛菌居群的基因组DNA；⑵从三个居群中各随机选取一个个体的基因组DNA进行混合后，检测所述总DNA的质量，并制备基因文库，经库检合格后，进行Illumina HiSeq^TM2500测序；⑶测序数据拼接完成后，使用SR search 软件检测所述总DNA序列中简单重复序列SSR并运用primer3进行引物设计；⑷采用温度梯度法获得退火温度为50~60℃并产生唯一、明亮条带的SSR引物；⑸利用所述SSR引物对三个居群的所述黄绿卷毛菌基因组DNA分别进行PCR扩增，并进行测序及多态性验证，获得具有多态性的12对引物：GSSR3L引物的上游引物有20个碱基GCTCAGCGTGAGTCACAAAA，其下游引物有20个碱基GAGCGCAACCCCTGTATATC；GSSR6L引物的上游引物有20个碱基CGACCTCTGCTCCAGGTAAA，其下游引物有20个碱基CACTGCACCAAATAGCCAAG；GSSR7L引物的上游引物有20个碱基 AAACTCGGGAGGATTTTTCG，其下游引物有20个碱基CGACACTCGTTTGTGCTGTT；GSSR9L引物的上游引物有21个碱基GCAGGTATTTTTCCCATTACTGA，其下游引物有20个碱基AGCTTTGGCGAGGTTATTGTT；GSSR11L引物的上游引物有20个碱基 TAGTCCAAACCCAGCACCTC，其下游引物有20个碱基 TGCCGTTGGACATTTCTATG；GSSR26L引物的上游引物有20个碱基CCTTAGAACGACCTCCCACA，其下游引物有21个碱基GACGGAGCTTGAGAAGTTGG；GSSR33L引物的上游引物有23个碱基GCATTGTCAAAGGGTGTCAATAG，其下游引物有22个碱基GTTTGTTGATAGTAGTCGGCCC；GSSR36L引物的上游引物有20个碱基GCACGATCAATATGTTGGAC，其下游引物有21个碱基AGACACAGCCGCTACTCGTGA；GSSR45L引物的上游引物有20个碱基TTGGTATGGGCGCTGTAAGT，其下游引物有20个碱基 AACAAAATCGACCGCCATCA；GSSR46L引物的上游引物有21个碱基 TTATCGACAGTTGGTATGGGC，其下游引物有20个碱基AACAAAATCGACCGCCATCA；GSSR47L引物的上游引物有21个碱基ACACTCACGATCAAGTGCAGG，其下游引物有21个碱基 TCACTCAGCGTTGCTCTCGTT；GSSR49L引物的上游引物有20个碱基CCTCCTTTGCAATGAATTCC，其下游引物有20个碱基 TTGGACCCTCTTTTCCATCA；⑹利用软件Genalex 6.5计算等位基因数N_a、单倍型多样性H_d遗传分化系数F_ST、核苷酸多样性P_i、G_ST以及π值。