[发明专利]一种以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法

摘要

本发明公开了以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法。将能构成ATP适配体的两段DNA分别修饰上嵌有纳米铂颗粒的二氧化硅球和磁珠。在ATP存在的情况下，由于这两段DNA与ATP的特异性识别并结合，能够形成三明治夹心结构，从而将纳米铂固定在磁珠上，通过分离磁珠与溶液，并将清洗过的磁珠在密闭容器中与过氧化氢溶液反应，过氧化氢催化所产生的氧气积累能够提高氧分压，利用不同氧分压对压敏涂料的荧光猝灭程度不同，间接检测ATP的浓度。该技术成功地应用于人体血清中ATP浓度检测。这种检测使用荧光分光光度计做为检测手段，也可直接用裸眼进行比色检测，具有检测成本低、操作简单、定量结果准确，能即时检测，便携等优点。

主权项

1.一种以压敏涂料为信号读出的便携检测ATP含量方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将200 μL、0.05 mg/mL压敏涂料涂于2毫升的离心管内壁，并将该离心管作为信号读出工具；(2)制备以硅球为纳米铂颗粒载体的催化剂：以正硅酸乙酯为硅源合成二氧化硅球，再用原位生长法在其表面嵌入纳米铂颗粒使其具有催化性能；最后再修饰上氨基基团以便于该材料的后续使用；(3)以Sulfo‑SMCC为交联剂，将1 mL浓度为0.10 mg/mL的催化剂，即步骤（2）中所制备的嵌有纳米铂的二氧化硅球修饰到100 μL、100 μM DNA链上；(4)将修饰有链霉亲合素的磁珠分散于PBS缓冲溶液中，加入100 μL 浓度为100 μM修饰有生物素的DNA，室温振荡30分钟，制备修饰在磁珠上的DNA化合物；(5)将步骤（3）修饰有嵌有纳米铂的二氧化硅球的DNA化合物与步骤（4）修饰在磁珠上的DNA化合物混合，加入ATP的待测样品，室温培育1.5小时，形成磁珠—ATP—催化剂三明治结构型物质；(6)用磁铁分离步骤（5）中的磁珠—ATP—催化剂与其他物质，用磷酸盐缓冲溶液洗涤磁珠三次后，加入10 μL磷酸盐缓冲溶液，重新分散，得到与目标位浓度成相关关系的磁珠—ATP—催化剂混合液；(7)将上述所得全部液体加入到含有300 μL浓度为2.0 mol/L的过氧化氢的离心管中，并将该离心管置于（1）中的内壁涂有压敏涂料的离心管中进行检测；检测方法用目视法直接比色，或用荧光分光光度计进行准确检测；(8)以已知浓度的ATP溶液为横坐标，以相对应的荧光强度作为纵坐标，绘制曲线，得到ATP浓度—荧光强度线性方程: ΔIG=A+BlgC，然后根据线性方程和待测样品的荧光值计算相对应的待测样品中的目标位浓度, 其中ΔIG为反应前后荧光强度变化值；C为其所对应的ATP浓度，单位为nmol/L；步骤（1）中所用的压敏涂料为具有强荧光性且易被氧气猝灭的PtTFPP，是一种中心配位离子为铂的卟啉衍生物，激发波长为415纳米，吸收波长为645纳米；步骤（3）中所述的修饰有催化剂的DNA化合物序列为从左到右5’到3’：HS‑(CH2)6‑ACCTGGGGGAGTAT；步骤（4）中所述的修饰有生物素的DNA序列为从左到右5’到3’：TGCGGAGGAAGGT‑生物素。