[发明专利]利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号传导寡核苷酸杂交的靶核酸序列的检测

摘要

本发明涉及利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸‑依赖性信号传导寡核苷酸杂交(PCE‑SH，PTO Cleavage and Extension‑Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization)的靶核酸序列的检测。本发明不使用与靶核酸序列杂交来提供靶信号的探针。本发明利用与以靶‑依赖性的方式形成的延伸链杂交的探针(信号传导寡核苷酸)，将具有人为选择的序列的捕捉和模板化寡核苷酸作为模板合成上述延伸链。

主权项

1.利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸‑依赖性信号传导寡核苷酸杂交测定来检测靶核酸序列内的核苷酸变异的非诊断方法，其中包括：(a)使所述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸进行杂交；所述上游寡核苷酸包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；所述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’‑靶向部位，其包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；(ii)5’‑标记部位，其包含与所述靶核酸序列非‑互补的核苷酸序列；以及(iii)核苷酸变异区别位点，其包含与靶核酸上的核苷酸变异互补的序列；所述核苷酸变异区别位点位于3’‑靶向部位的5’‑末端部分，所述3’‑靶向部位与所述靶核酸序列杂交，所述5’‑标记部位不与所述靶核酸序列杂交，所述上游寡核苷酸位于所述探测和标记寡核苷酸的上游，所述上游寡核苷酸或其延伸链诱导具有5’核酸酶活性的酶对探测和标记寡核苷酸的切割；(b)在用于切割所述探测和标记寡核苷酸的条件下，使所述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；其中当所述探测和标记寡核苷酸与具有对所述核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交，并且所述3’‑靶向部位的5’‑末端部分与靶核酸序列形成双链而诱导从第一初期切割位置切割时，则放出第一片段；其中当所述探测和标记寡核苷酸与具有对所述核苷酸变异区别位点非‑互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交，并且所述3’‑靶向部位的5’‑末端部分不与靶核酸序列形成双链而诱导从位于第一初期切割位置下游的第二初期切割位置进行切割时，则放出第二片段；所述第二片段包含额外的3’‑末端部位，这使第二片段与第一片段不同；(c)使从所述探测和标记寡核苷酸放出的所述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交；所述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与所述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位互补的核苷酸序列或者与5’‑标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含分别与所述探测和标记寡核苷酸的5’‑标记部位以及3’‑靶向部位非‑互补的核苷酸序列；从所述探测和标记寡核苷酸放出的第一片段或第二片段与所述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；(d)利用模板‑依赖性核酸聚合酶及所述步骤(c)的结果物来实施延伸反应；若所述第一片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则所述第一片段被延伸，来生成包含与所述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链，若所述第二片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则不被延伸；(e)使所述延伸链与信号传导寡核苷酸杂交的步骤；所述信号传导寡核苷酸包含与所述延伸链互补的序列以及至少一个标记，且所述信号传导寡核苷酸与所述延伸链杂交来提供能够检测的信号；以及(f)检测所述信号；所述信号的检测表示与所述探测和标记寡核苷酸的核苷酸区别部位互补的核苷酸变异的存在。