[发明专利]粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法

摘要

本发明公开了一种粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，包括以下步骤：a）将待测粗品肝素钠溶于含有氯化钠和乙醇的水溶液中，再加入生物磁珠，通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA，b）设计猪、羊、牛源性成分鉴别引物；c）以待测粗品肝素钠总DNA为模板，采用猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别进行PCR扩增；d）将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，根据得到的特异性条带分子量大小来判断该待测粗品肝素钠的种属来源。本发明提供的鉴别方法可有效解决传统方法中存在的肝素对PCR抑制的问题，而且大大降低了成本，方法简洁明了，快速简便，重复性好，易操作，准确性高，适于在粗品肝素钠种属来源鉴别中推广应用。

主权项

1.一种粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：（a）将待测粗品肝素钠溶于溶剂A中，再加入生物磁珠，通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA，得待测粗品肝素钠总DNA；所述溶剂A为每100mL水中溶有2g氯化钠和10g乙醇；所述粗品肝素钠、溶剂A、生物磁珠的质量体积比为30mg:1mL:30μL；（b）设计猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别为：猪源性成分鉴别引物：上游引物：ATCTACATGATTCATTACAATTAC，下游引物：CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA；羊源性成分鉴别引物：上游引物：ACACAACTTCTACCACAACCC，下游引物：AAACAATGAGGGTAACGAGGG；牛源性成分鉴别引物：上游引物：GCCATATACTCTCCTTGGTGACA，下游引物：GTAGGCTTGGGAATAGTACGA；（c）以步骤（a）所得待测粗品肝素钠总DNA作为DNA模板，采用步骤（b）设计的猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别进行PCR扩增，其扩增体系为：DNA模板3μL、上游引物 1μL、下游引物1μL、2倍浓度PCR试剂预混液 25μL，用ddH₂O补齐至50μL；PCR反应程序为：在95℃下预变性5min；在95℃下变性15s；在63℃下退火30s；在72℃下延伸30s；热循环40次；得扩增产物；（d）将所述扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，如得到了分子量大小为150bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有猪源性肝素钠成分；如获得了分子量大小为145bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有羊源性肝素钠成分；如获得了分子量大小为271bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有牛源性肝素钠成分。