[发明专利]一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法

摘要

本发明主要属于高等生物体基因组编辑技术领域，具体涉及一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法。所述方法基于T7 RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子‑sgRNA，将T7启动子‑sgRNA、Cas9表达质粒以及T7 RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7 RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点处，进行切割，完成基因编辑过程。本发明所述方法利用T7启动子表达sgRNA，简化了CRISPR/Cas9系统的设计步骤，使得更多的人能够快速简便使用CRISPR/Cas9这一基因编辑工具研究感兴趣的基因位点。

主权项

1.一种应用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法基于T7 RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子‑sgRNA，将T7启动子‑sgRNA、Cas9表达质粒以及T7 RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7 RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点处进行切割，完成基因编辑；其中，所述T7启动子‑sgRNA的构建方法为：选取上游引物与下游引物，以Cas9‑sgRNA共表达载体为模板进行PCR反应扩增，得到T7启动子‑sgRNA的PCR产物；所述上游引物包括T7启动子序列、20bp sgRNA引导序列以及20bp sgRNA scaffold序列；所述下游引物为一段与sgRNA scaffold序列3’‑5’方向匹配的序列。