[发明专利]一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根的方法

摘要

一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根的方法，它涉及一种诱导食用甜菜产生毛状根的方法；本发明以食用甜菜下胚轴为外植体，用活化了的发根农杆菌进行转化，使发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA上的致发根基因整合到食用甜菜外植体细胞核DNA中，表达形成毛状根，每一个发根即为一个单克隆。经过多次继代培养及反复筛选，逐步建立起食用甜菜发根悬浮培养无性系。本发明的方法易行，操作简便，生长条件容易控制，实验观察方便，本发明为发根农杆菌介导的遗传转化应用于利用食用甜菜发根培养生物合成甜菜红素等功能性次生代谢产物及食用甜菜品种改良提供了一条有效途径。

主权项

一种利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：步骤一、外植体的制备取干燥保存的甜菜种子，磨光种子外部的木质化花萼，使种球表面光滑，流水浸泡15～18h，取出后自然干燥2h，于超净台上进行灭菌处理：在质量百分含量为75％乙醇中浸泡2min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，用NaClO灭菌8min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，用质量百分含量为80.1％的升汞灭菌13min，无菌水漂洗4次，每次不少于1min，置于MS培养基上，培养2天后，再暗培养培育4～5天后，得到无菌苗；步骤二、发根农杆菌的活化将低温保存的发根农杆菌K599或ATCC取出，接种200μL于10mL液体YEB内，于温度为28℃、转速为150r/min的黑暗条件下震荡培养12～15h，培养至菌液OD₆₀₀＝0.6～0.8，然后将菌液转入50mL离心管中，在转速为6000r/min的条件下离心10min，用MS液体培养基重悬至OD₆₀₀＝0.6，菌悬液备用；步骤三、发根农杆菌浸染及共培养(1)外植体的预培养：将由步骤一获得的生长3～4d的食用甜菜无菌苗取出，切去种子无菌苗根部和下胚轴以上部分，将切好的下胚轴转接至已灭菌的1/2MS固体培养基中，放置于22～28℃生化培养箱中暗培养1～2d，完成下胚轴的预培养阶段；(2)菌液共培养：取出预培养后的下胚轴，放置于灭菌的干净的培养皿中，将步骤二的菌悬液倒入培养皿中，期间不停震荡培养皿，浸染10～15min，然后将浸染后的下胚轴取出，用滤纸吸干表面多余菌液，然后接种在1/2MS固体培养基中，培养基上放置灭菌滤纸，过夜后，将茎段转移至普通1/2MS固体培养基上暗培养1～2天；(3)除菌培养：在无菌条件下，将完成共培养的下胚轴转接至1/2MS+Cef500mg/L的液体培养基中于28℃、120r/min条件下进行脱菌培养1h，然后无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸将茎段上的水分吸干，转移至1/2MS+Cef500mg/L的固体培养基中进行暗培养10～16d；步骤四、毛状根除菌在步骤四除菌培养中的下胚轴毛状根长至3～7cm，剪取毛状根，置于1/2MS+Cef500mg/L的基本培养基上进行继代培养，直至完全除去农杆菌；步骤五、继代培养将步骤四除菌后的根放于40mL的MS培养基中进行传代培养，黑暗中，24～26℃培养，即完成所述的利用发根农杆菌高效诱导食用甜菜产生毛状根。