[发明专利]一种从柽柳组织中提取总RNA 的方法

摘要

一种从柽柳组织中提取总RNA的方法，通过用试剂盒结合添加PVPP粉改进传统提取RNA的方法，使得不易提取的植物材料RNA提取效果和质量提高。主要的技术流程包括试剂盒设备提取前处理，提取RNA的详细过程，以及后期RNA浓度和质量控制检测。用该方法从柽柳组织中提取总RNA浓度高，质量好，没有蛋白质和其它的杂质污染。这项发明为提取荒漠中多盐多酚类的植物的RNA提取提供了参考。

主权项

一种从柽柳组织中提取总RNA的方法，该方法包括试剂盒设备提取前处理， 提取步骤，质量检测；其特征在于：所述试剂盒设备提取前处理：将离心管、药勺和研钵用0.1% DEPC的水溶液浸泡 12 小时，然后用铝泊纸包裹，高压蒸汽灭菌和干燥；用 70%酒精喷雾清洗离心机、试验台、试管架和移液器，然后用无菌纸巾擦干，反复2‑3次，确保实验台及实验所有仪器及设备无污染；所述提取步骤包括：1)在RNA Wash Buffer II 中加入48 ml 95% 的乙醇， 上下颠倒，充分混匀，备用；2）在5ml试管中加入E.Z.N.A® Plant RNA Kit (Omega Bio‑tek, Doraville, GA, USA) 裂解液RCL 4 ml,再加入4×20 μl的β‑巯基乙醇,盖上盖子,在涡旋振荡器上轻轻振荡,充分混匀,总体积共达4080 μl；3）用1000 移液器移取步骤2）中700 μl 裂解液RCL与β‑巯基乙醇的混合溶液， 加入1.5 ml 或 2 ml 经液氮预冷过的自备离心管中，放置预冷过的试管架上备用；4）称交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)粉，PVPP粉的量为柽柳组织样品重量的2%，分别放入四个完全预冷并装有液氮的研钵中；5）在装有PVPP的研钵中，分别放入新鲜的或者液氮冷冻的柽柳根、茎、叶、花组织进行充分研磨； 把研磨后的柽柳根、茎、叶、花组织粉末，分别放入步骤3)盛有700 μl 裂解液RCL与β‑巯基乙醇的混合溶液1.5 ml 或 2 ml的 4个自备离心管中，盖上盖子，在涡旋振荡器上充分振荡2～5分钟，然后放入50℃水浴锅水浴，水浴期间取出振荡几次，充分混匀；所述研磨后的柽柳根、茎、叶、花组织粉末不能低于70 mg，而且不能超过100 mg；6）将步骤5）中装有样品和裂解液的4个离心管取出水浴，放入eppendorf离心机中，以14000 rpm转速离心 2分钟，取出离心管，放置在试管架上；7) 用1000 ul的移液器移取步骤6）离心管中的上清液600 μl到新的1.5 ml 或 2 ml 离心管中； 然后用移液器枪加入300 ul 的95% 的乙醇，枪头不出离心管，吸入排除反复5‑10次，至完全混匀；8）将HiBind^® RNA Mini 柱置放在2 ml收集管上，转移步骤7）离心管中所有溶液到HiBind^® RNA Mini 柱上，然后 10000 rpm离心 1分钟；9）弃掉收集管中的废液，重新在HiBind^® RNA Mini 柱上加入400 ul RWC Wash Buffer， 10000 rpm离心 30秒；10）弃掉收集管中的废液，用移液器取步骤1）配置好的 RWC Wash Buffer II 400 μl，加到HiBind^® RNA Mini 柱上，10000 rpm离心30秒；11) 分别加入预先配置的DNaseI 80 ul（70 ul DNase 酶，10 ul 共320 ul），放置15 分钟；然后用10000 rpm离心 30秒；倒掉收集管中的废液，再10000 rpm离心 20秒，甩掉管壁的残液；12）把HiBind^® RNA Mini 柱放置在新的1.5 ml 的收集管上，打开HiBind^® RNA Mini 柱盖子2分钟；13）在HiBind^® RNA Mini 柱中央，加入30‑50 ul DEPC水后， 盖上盖子，静置3分钟；用14000 rpm离心 2分钟；得到的RNA放‑80℃存储；所述质量检测：1）Nanodrop 检测RNA质量，取 l ul提取的多枝柽柳（Tamarix ramosissima ）根、茎、叶、花组织的 RNA 在NanoDrop 2000 仪器上检测，检测设定为 RNA，结果显示260/230 的值大于 1.5；260/280的值大于1.8；2）Bioanalyzer RIN值及rRNA Ratio检测，以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳(capillary electrophoresis)，并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估，检测结果在7.4和7.6之间，5S、18S及28S rRNA峰非常尖锐，RNA完整性好；3）琼脂糖电泳检测RNA质量，取500 ng提取的多枝柽柳的 RNA在1%的琼脂糖胶电泳分离，电泳电压为 105 V/cm，电泳时间为15 min ；Gel‑red染色，BioRad凝胶成像仪检测和照相；提取的 RNA 琼脂糖胶电泳检测具有5S、18S和28S三个条带，条带清晰可见。