[发明专利]一种EHV-1血清抗体检测试剂盒及制备方法和应用

摘要

本发明公开一种EHV‑1血清抗体检测试剂盒及制备方法和应用，EHV‑1血清抗体检测试剂盒采用由塑料小盒作为外壳，预制的NC膜和滤纸构成试剂盒内芯，试剂盒外壳为长方体结构，NC膜分别包被纯化的EHV‑1 gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，以纯化的EHV‑1 gD包涵体蛋白做为检测抗原，猪免疫球蛋白IgG为质检蛋白，按外壳盖‑NC膜‑滤纸‑外壳底的顺序组装起来，以金标SPA为二抗，以PBS为包被液，以PBS为洗涤液，采用抗原抗体特异性结合原理用来检测马血清样品中EHV‑1抗体情况，该方法快速、可视、操作简单，适合基层人员使用，具有广泛应用价值。

主权项

1.一种EHV-1血清抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，具体采用如下方法步骤获得：(1)制备NC膜：NC膜分别包被纯化的EHV-1gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，其中EHV-1gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG两种蛋白都采用滴加蛋白质溶液于NC膜自然晾干方法进行包被，纯化的EHV-1gD包涵体蛋白做为检测抗原，猪免疫球蛋白IgG为质检蛋白，其中，采用以EHV-1新疆株本地株基因组为模板设计合成特异性引物：UP：5'-GGTGGATCCATGAAATGCAACCCGAAG-3'Down:5'-GGCCTCGAGTTACACAAACGTAGAGTTGCTCTT-3'在上游引物引入BamH I、下游引物引入Xho I酶切位点，并在下游引物引入TAA终止密码子，通过PCR反应扩增去除N端信号肽及C端跨膜区的gD部分基因，将gD部分基因克隆至pET28a原核表达载体上构建pET28a-gD重组质粒，转化至BL21(DE3)感受态细胞内，利用含有50ug/mL卡纳青霉素的固体LB培养基筛选阳性克隆株，LB液体培养基中培养阳性克隆株至OD600＝0.6时，加入0.9mmol/L IPTG在25℃条件下进行诱导表达6h后收集细菌，菌体超声破碎后离心收集包涵体沉淀，利用PBST洗涤3-5次既可获得gD包涵体蛋白；(2)组装试剂盒：按盒底-吸水材料-NC膜-盒盖的顺序组装起来，先将吸水材料放置在试剂盒底部，再将NC膜放置在吸水材料上方，最后将盒盖封闭盒体，试剂盒采用由长方体作为试剂盒的外壳，预制的NC膜和滤纸构成试剂盒内芯，试剂盒包括，盒盖、NC膜、吸水材料和盒底，盒盖中央设有直径为0.5cm的加样孔，盒底设有一层吸水材料，NC膜位于吸水材料垂直上方，其中，NC膜分别包被纯化的EHV-1gD包涵体蛋白和猪免疫球蛋白IgG，试剂盒的盒体呈长3.0cm、宽3.0cm、高0.5cm的长方体结构。