[发明专利]一种动态示踪监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法

摘要

一种动态示踪监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法，其特征在于：使用吡啶环2H标记的烟碱（[2H4]‑(±)‑Nicotine）与未标记的烟碱等比例混合后暴露动物，利用微透析系统分别收集血、脑透析液样品于微量离心管中，加入分析内标短时低速离心后，直接上样超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱分析检测微透析样品中的烟碱代谢物及其吡啶环2H标记物，根据试验结果鉴定烟碱代谢物并绘制相应的时间‑浓度曲线进行动态监测分析。本发明的优点在于：能准确示踪鉴定出动物体内的多种烟碱代谢物，极大地简化了样品前处理步骤，实现了动物体内不同系统中烟碱代谢物变化的准确分析与同步比较，开创了一种新的用于动物体内烟碱代谢研究的方法。

主权项

1.一种动态示踪监测动物体内烟碱及其代谢物的分析方法，其特征在于：采用烟碱与其吡啶环2H同位素标记物溶液同时暴露动物，利用微透析系统同步收集动物血透析液及脑组织透析液样品于不同的微型离心管中，加入分析内标后，采用超高效液相色谱‑轨道阱高分辨质谱分析检测样品中的烟碱代谢物及其吡啶环2H标记物，根据试验结果鉴定烟碱在脑、血中的代谢物组成并进行定量分析，绘制相应的烟碱代谢物浓度‑时间变化曲线进行动态监测分析；具体包括以下步骤：a．采用等比例混合的烟碱与吡啶环2H标记的烟碱溶液以外周注射方式暴露动物；b. 同步且分别收集动物摄入烟碱后的血液微透析样品和脑微透析样品于不同的微型离心管中，该离心管既能与微透析样品收集系统配套使用又能与色谱进样瓶配套使用；c.分析内标溶液配制：以稳定同位素Nic‑d3作为分析内标物，配制浓度为20ng/mL的内标工作溶液；d. 混合标准溶液配制：分别准确称取Nic、Cot、NorNic、NNO、OH‑Cot、NorCot、CNO、Nic‑Gluc、Cot‑Gluc、OH‑Cot‑Gluc、OxPyBut和HyPyBut标准品，配制浓度梯度的系列混合标准溶液，并各加入内标工作溶液，使内标物的浓度为5ng/mL，混合标准溶液的浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.0和50.0ng/mL；e. 标准曲线绘制：将系列混合标准溶液按由低到高的浓度顺序进行分析，以各目标分析物的色谱峰面积与内标峰面积之比（Y）对其相应的浓度（X）进行线性回归，得到标准曲线回归方程；f．样品检测及数据处理：将步骤b收集的微型离心管置于色谱进样瓶内，加入10μL浓度为20ng/mL的混合内标工作溶液，短时低速离心后上样分析, 具体为1000r/min离心10s；利用准确分子量[M]峰与同位素[M+4]峰匹配出现的特征鉴定样品中目标物，根据标准曲线法计算透析液样品中各目标物的含量，依据结果分别绘制血、脑内各代谢物的浓度‑时间变化曲线，并进行药代动力学分析，揭示烟碱在大鼠体内的代谢规律；色谱条件、质谱条件具体如下：色谱柱：Waters Atlantis HILIC Silica ，规格3 ×100 mm, i. d. , 3 μm；柱温：30 ℃；流动相：A：10 mmol/L 乙酸铵水溶液，该水溶液中含0.1%甲酸，B：含0.1%甲酸的乙腈；流速：0.6 mL/min；梯度洗脱；进样量：10 µL；柱平衡时间为2 min；梯度洗脱条件见表1；表1 梯度洗脱条件时间‑min流动相A%流动相B%059521585525755.55958595质谱条件离子源：加热型电喷雾（HESI）；离子源温度：300 ℃；正离子模式下电喷雾电压：3.5 kV；鞘气：206.85 kPa；辅助气流速：3.33 L/min；传输毛细管温度：320 ℃；扫描模式：全扫描/数据依赖二级扫描FS/ddMS2，一级全扫描分辨率R=70000，二级扫描分辨率R=17500。