[发明专利]N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测

摘要

本发明涉及N‑酰基高丝氨酸内酯(AHL)酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测，通过构建能够表达AHL酰基转移酶的基因重组菌，对该酰基转移酶利用复合自诱导培养基及变温分批发酵方式进行发酵罐水平的高效发酵，得到高酶活力的发酵液及高比活力的AHL酰基转移酶；利用Quantity one软件对蛋白定量分析，能够快速地对发酵过程不同时间细胞内AHL酰基转移酶总浓度进行准确定量；同时本发明还构建了专用于该酶活力检测的体系，实现准确快速检测酶活力的目的。本发明可以降低AHL酰基转移酶的生产成本，实现AHL酰基转移酶的高效生产，同时对发酵过程中AHL酰基转移酶的浓度及纯化后AHL酰基转移酶的活力进行准确快速的测定，该酶可作为一种新型的病害防治酶制剂使用。

主权项

1.N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO的高效生产方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：构建含aiiO基因的重组表达载体；/nS2：将重组表达载体转化大肠埃希氏菌得到重组菌；/nS3：将重组菌接种于高密度增殖液体培养基中，37℃，220rpm振摇培养过夜；取重组菌过夜培养液，以1‰接种于复合自诱导培养基中，发酵罐装液量为总容积的60％～75％，转速300～500rpm，通气量3～4L/min，以二甲基硅油为消泡剂，消泡剂用量为0.3‰；OD600达到0.8～1.0，将发酵温度降低至25～30℃，控制相对溶氧20％～30％，通过发酵获得重组蛋白AiiO；利用Quantity one软件分析SDS-PAGE电泳胶中蛋白电泳条带的光密度值，以分子筛纯化蛋白的上样量为参照，对发酵过程中不同时间的全蛋白表达量进行定量/nS4：利用镍亲和层析对重组蛋白AiiO进行纯化；/nS5：建立酶活力测定体系，用反相高效液相色谱测定AHL酰基转移酶活力；所述酶活力测定体系：信号分子C6-HSL溶液与AiiO蛋白的质量浓度比为99.625:1，缓冲液为100mmol/LTris-HCl溶液，pH 7.0；反应条件为30℃反应15min，用反应体系总体积10％的乙腈终止反应；紫外检测波长为190nm，流动相：乙腈/水(30/70)；流速：0.5mL/min/n高密度增殖培养基组成为：Na