[发明专利]一种固定化卤醇脱卤酶及其应用

摘要

本发明公开一种固定化重组卤醇脱卤酶及其应用；本发明构建的固定化重组卤醇脱卤酶对卤醇底物转化效率高，底物耐受性强，对底物及其结构类似物具有良好的催化选择性；本发明通过多点共价成功将重组卤醇脱卤酶固定在环氧树脂载体表面；通过低盐吸附和添加甘油作为酶活性中心的保护剂，有效减少了固定化过程中的酶活损失；该固定化方法操作简单，原料成本低，适合大规模操作；固定化酶具有性状均一、酶稳定性高、重复使用性能好等优点；采用该固定化重组卤醇脱卤酶可以用于合成环氧氯丙烷、(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯、(S)‑2,3‑二氯‑1‑丙醇等，在固定化酶活力没有出现明显下降前可以连续使用50批以上，具有很好的工业应用前景。

主权项

一种固定化重组卤醇脱卤酶，其特征在于所述酶按如下方法制备：(1)将含重组卤醇脱卤酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的发酵液离心，去除上清液，将菌体沉淀用pH＝7.0、0.1M的磷酸钠缓冲液悬浮后进行破碎、离心，取破碎上清液；所述重组卤醇脱卤酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；(2)取步骤(1)中的破碎上清液为酶源，向酶源中加入pH＝7.0、0.1M的磷酸钠缓冲液，混匀，形成待固定酶液，将待固定酶液与载体混合，在25℃下搅拌5h‑20h，取出载体用蒸馏水冲洗后，放入pH值8.5、0.1M的磷酸钠缓冲液中，再加入甘油，25‑30℃下保温1‑3天，获得保温后的载体；所述酶源的含酶量以破碎前湿菌体重量计为0.1g/ml，所述待固定酶液中酶源的体积终浓度为0.1％～8％；所述载体质量以待固定酶液中缓冲液的体积用量计为0.01‑1g/ml；所述甘油体积终浓度为20％；所述载体为环氧树脂；(3)将步骤(2)保温后的载体浸入pH＝8.5，1.0‑3.0M的甘氨酸水溶液中，25℃保温24h，最后再用蒸馏水冲洗，得到固定化重组卤醇脱卤酶。