[发明专利]一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法

摘要

本发明涉及一种小的DNA分子量标准物、标准物质粒及其制备方法，本发明是利用重叠聚合酶链式反应、限制性内切酶酶切和DNA连接等方法将100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp等长度的小的DNA序列构建到一个质粒上。这种质粒经单一的限制性酶完全酶切后，可以酶切出七条亮度均一的条带。本发明用于制备DNA标准参照物，用于在琼脂糖电泳中指示DNA分子量的相对大小。

主权项

1.一种小的脱氧核糖核酸分子量标准物的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(一)分子量标准物质粒的构建方法：Step 1：M1A的构建：①以pUC19为模板，设计4对PCR引物，分别扩增出500bp、600bp、400bp和700bp的DNA条带；②加入两端引物，通过重叠PCR的方法将①中的四个片段拼接在一起，成为DNA长片段，并在DNA长片段两端引入BamHI酶切位点；③以质粒PUC19为骨架质粒，BamHI酶切DNA长片段和骨架质粒，并将DNA长片段连接在骨架质粒上，即为M1A质粒；Step 2：M1B质粒的构建：①以克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的染色体DNA为模板，该模板的DNA序列中只有一个EcoRI酶切位点；②设计引物进行PCR扩增，所述引物的5’端带有HindIII和EcoRI酶切位点，根据引物扩增一400bp长度的DNA片段；所述400bp长度的DNA片段经EcoRI单酶切后能够获得两个200bp的片段；③HindIII单酶切400bp长度的DNA片段和M1A质粒，并将二者连接在一起，即为M1B质粒；Step 3：M1C质粒的构建：①同样以克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的染色体DNA为扩增区域，设计一对引物，该引物的5’端包含BamHI和EcoRI位点；②根据引物进行PCR扩增，PCR产物为600bp的片段，该PCR产物经EcoRI单酶切后能够得到一个200bp和一个400bp的片段；③BamHI单酶切PCR产物和M1B质粒，将二者连接在一起，即为M1C；Step 4：M1D质粒的构建：①同样以克隆有小鼠IGF2BP2基因组DNA的染色体DNA为扩增区域，设计一对引物，该引物的5’端包含有XbaI和EcoRI位点；②根据引物进行PCR扩增，得到长度为600bp的PCR产物，经EcoRI单酶切后能够获得两个300bp的片段；③XbaI单酶切PCR产物和M1C质粒，并将二者连接在一起，即为M1D；Step 5：M1E质粒的构建：①pUC18Ava质粒构建：A.合成序列ESASHF和ESASHR，ESASHF为5‑AATTCGTCGACCTCGGGGTCGACA‑3，ESASHR为5‑TCGAACAGCTGGGGCTCCAGCTGC‑3；合成后进行退火，得到两端带EcoRI和HindIII粘末端的片段，同时引进了一个Ava I酶切位点以及在其两侧各有一个SalI酶切位点；B.用EcoR I和Hind III双酶切pUC18质粒，获得线性化的带有EcoR I和Hind III粘末端的载体；C.将步骤①中退火后的片段与步骤②中线性化的载体连接，得到pUC18Ava质粒，备用；②AvaE100片段的获得：合成引物，并在上游引物中引入AvaI和EcoRI酶切位点，下游引物中引入AvaI酶切位点，再以Pfu聚合酶基因为模板进行PCR扩增，得PCR产物，其5’端包含一个EcoRI，该PCR产物为含有100bp长度的AvaE100片段；③克隆AvaE100重复序列的质粒：A.单个AvaE100用AvaI单酶切，电泳，回收特异性的100bp长度的片段；B.建立连接体系，将100bp长度的片段进行连接，回收1000bp长度的片段，即为AvaE100重复片段；C.测序准确的pUC18Ava质粒用AvaI充分酶切，然后进行去磷酸化；D.将步骤B中回收的1000bp的AvaE100重复片段和步骤C中AvaI线性化、去磷酸化的pUC18Ava质粒进行连接，得到插入10个AvaE100的克隆在pUC18质粒上的质粒；④M1E质粒构建：利用步骤③pUC18Ava中的SalI酶切位点将AvaE100重复片段克隆到含有SalI酶切位点的M1D质粒中，获得一个插入了10个100bp片段的质粒，即为M1E，所述M1E含有10个100bp片段、3个200bp片段、2个300bp片段、2个400bp片段、1个500bp片段、1个600bp片段和1个700bp片段；(二)M1E质粒DNA纯化；(三)M1E质粒DNA酶切：所述M1E质粒能够进行完全酶切获得小的脱氧核糖核酸分子量标准物。