[发明专利]一种牛篣苷元的制备方法

摘要

本发明公开了一种牛篣苷元的制备方法，其包括以下步骤：菌种活化、制备种子菌液、利用里氏木霉和泡盛曲霉发酵牛蒡子粉、超声波协助提取牛蒡子粗提物、硅胶柱层析纯化。本发明以牛蒡子粉为原料采用生物发酵技术制备牛蒡子提取物，利用β-葡萄糖苷酶和纤维素酶高产菌株发酵炮制牛蒡子粉，在体外可控条件下使牛篣苷的糖苷键断裂转化为牛篣苷元，提高了牛蒡子中牛篣苷元的含量，并采用简单有效的提纯方法，能够提取较高纯度的牛篣苷元。

主权项

一种牛篣苷元的制备方法，其特征在于：本发明采用的发酵菌种为里氏木霉(Trichodermareesei，CICC40932)和泡盛曲霉变种(Aspergillusawamorivar，CICC2203)；所述的制备方法包括以下步骤：(1)菌种活化：将处于真空干燥管内并低温保存的菌种冻干粉取出后恢复至室温，转移至超净工作台内，以沾有75％酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管尖端，滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，取出隔热均匀涂布于PDA平板上，分离培养1～2d，培养温度为28～30℃；(2)制备种子菌液：将活化好的菌株接种于PDA平板上，置于恒温培养箱内在28～30℃下培养5～6d，加入无菌水至平板中晃动，冲下琼脂表面的孢子，过滤，取得孢子悬浮液，计算孢子浓度，并配制成孢子浓度为10⁶～10⁷个/mL的悬浮液，将孢子悬浮液按1：25的体积比置于Mandel培养液中在28～30℃下培养1～2d即得种子菌液；(3)牛蒡子粉的发酵炮制：将里氏木霉种子菌液和泡盛曲霉变种种子菌液按接种比为1:1～4，接种量为1～5mL/110mL接种至发酵培养基中，在30℃下发酵培养36～168h，发酵完后向发酵培养基中添加10mol/LNaOH至NaOH的质量分数为2％，终止发酵；(4)牛蒡子粗提物的制备：在100℃下烘干发酵后的培养基并粉碎，将粉碎后的烘干制品置于甲醇溶液中，并在功率80W，频率为20kHz下超声辐射20min，静置8～12h后过滤并收集滤液为牛蒡子粗提物溶液；(5)纯化：将硅胶，三氯甲烷充分溶胀后，湿法填入色谱柱，将牛蒡子粗提物溶液蒸干后溶于三氯甲烷中，上样，洗脱液为三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，10:2)，展开剂为氯仿：甲醇(v:v，95:5)，将洗脱液浓缩干燥，将干燥物再次用硅胶柱层析纯化，洗脱液改为三氯甲烷：乙酸乙酯(v:v，6:1)，收集洗脱液，干燥结晶。