[发明专利]一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法

摘要

一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法,包括所用材料为离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块、叶状体组织块分割、诱导叶状体、叶状体株系恢复生长过程、叶状体株系构建、重复诱导筛选高产石杉碱甲叶状体株系、叶状体株系分割继代、高产石杉碱甲叶状体株系的建立与鉴定。运用本发明的方法进行蛇足石杉离体培养，可获得大量高产石杉碱甲的叶状体药用植物资源。

主权项

一种诱导蛇足石杉离体叶状体高产石杉碱甲的方法,其特征在于:(1)所用材料：材料为离体培养建立的蛇足石杉叶状体组织块；该材料制备方法已申请专利,专利号ZL201210005499.6，专利名称“产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法”；(2)叶状体组织块分割：在无菌条件下，将叶状体组织块分成单片叶状体备用；(3)诱导叶状体：将单片叶状体置于3％双氧水处理13～15分钟，弃双氧水处理液，然后用无菌水重复多次洗去双氧水残液，将叶状体接种到继代培养基上培养；(4)叶状体株系恢复生长过程：诱导材料接种在继代培养基上第三天至第十五天叶状体几乎全变白色，直到20天后，诱导的叶状体能长出绿色的培养物，以后生长速度加快，50天形成叶状体组织块；(5)叶状体株系构建：当代诱导的叶状体培养50天后,取半致死剂量为3％的双氧水处理13‑15分钟的恢复生长的培养物建立株系，将每块叶状体组织块分割后建成单个株系，并标记株系代号，以后按株系继代扩大培养，每50天为继代周期，连续培养5代，以高效液相色谱法检测每个株系的石杉碱甲含量,单位为ug/g；(6)重复诱导筛选高产石杉碱甲叶状体株系：选取石杉碱甲含量较高的叶状体株系，重复步骤(2)、(3)，取半致死剂量为3％双氧水浸泡13～15分钟胁迫诱导叶状体,经步骤(4)和(5)，定向筛选高产石杉碱甲的叶状体株系；(7)叶状体株系分割继代：分别从每株系取一小部分叶状体切割成小块作继代，接种到继代培养基上继代培养，以后每45～50天转代一次，分别建成叶状体无性繁殖株系；(8)高产石杉碱甲叶状体株系的建立与鉴定：每株系继代剩余的另一大部分叶状体培养物继续培养25～35天后收获，用作提取检测石杉碱甲含量，连续培养收获5代，世代间石杉碱甲含量高且重复一致的株系，鉴定为高产石杉碱甲叶状体株系；所述继代培养基按下列成份组成并进行配制：1/4MS+蔗糖2.5％+琼脂粉0.6％；培养基的pH值5.8～6.0,并在0.1MPa高温高压下灭菌25min后使用；培养参数：恒温23±2℃,相对湿度60％～70％，光照强度为1500～1800lx,日照时长13～15h/d。