[发明专利]一种天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料的制备方法

摘要

本发明公开了一种天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，该方法具体包括将哺乳动物任意软骨联合骨组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞软骨联合骨材料。本发明同时实现对全身任意软骨联合骨组织进行彻底去细胞化处理，更加高效便捷的获得均一性高的脱细胞软骨联合骨材料；本发明在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，本发明可以用于全身任意部位的骨科疾病。

主权项

1.一种天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：(1)取哺乳动物全身任意软骨联合骨组织用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织、毛发和韧带；(2)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温45℃摇床150rpm震荡8‑24小时；其中含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液摩尔浓度为1％‑5％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；(3)在有机溶剂溶液中，恒温45℃摇床150rpm震荡脱脂2‑12小时；有机溶剂溶液为等体积比的氯仿和甲醇溶液、摩尔浓度10％‑100％的丙酮溶液或摩尔浓度30％‑70％的乙醇溶液；(4)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素的混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡3‑72小时；含Triton X的PBS缓冲液为浓度1％‑10％的Triton X‑200或Triton X‑100的PBS缓冲液；含Triton X的PBS缓冲液与混合抗菌液的体积比为10:1；(5)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素的混合抗菌液，恒温45℃摇床150rpm震荡2‑96小时；含SDS的PBS缓冲液为摩尔浓度0.5％‑10％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1‑20mmol/L的Tris；含SDS的PBS缓冲液与混合抗菌液的体积比为10:1；(6)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素的混合抗菌液，37℃摇床150rpm震荡1‑12小时；含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.01‑0.5mg/ml；含DNA酶的PBS缓冲液与的混合抗菌液的体积比为5:1；(7)在无菌生理盐水中，37℃摇床150rpm震荡72小时，即得天然组织来源的软骨联合骨脱细胞材料；步骤(2)‑(6)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。