[发明专利]一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法，步骤如下选取国槐嫩枝消毒后，取带有腋芽或顶芽的茎段，接入芽启动培养基上，诱导顶芽和腋芽萌发；将诱导出的新梢去掉基部叶片，切成含腋芽或顶芽的茎段接种在试管苗增殖培养基上，获得无菌试管苗；取无菌试管苗的叶片接种在体胚诱导培养基上培养形成愈伤组织；将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养形成丛生芽小苗；将丛生芽小苗切成愈伤块转接到试管苗增殖培养基或不定芽诱导培养基上进行培养；将培养的丛生芽转入壮苗培养基中，进行壮苗培养后即可炼苗移栽。本发明方法，再生率高、出芽多，植株移栽成活率可达到95％以上，种苗生长健壮，不但可有效解决优良种苗种质退化问题。

主权项

1.一种诱导国槐离体叶片体细胞胚的快速繁殖方法，其特征是：包括以下步骤：(1)将国槐茎消毒后，取带有芽的茎段，接入芽启动培养基上，诱导顶芽和腋芽萌发，所述芽启动培养基为：改良的MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(2)将诱导出的新梢去掉基部叶片，切成含芽的茎段接种在试管苗增殖培养基上培养，获得无菌试管苗，所述试管苗增殖培养基为：改良的MS+1.0～2.0mg/L BA+1.0～2.0mg/LIBA+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(3)取无菌试管苗的叶片接种在体胚诱导培养基上培养形成愈伤组织，所述体胚诱导培养基为：改良的MS+3.0～5.0mg/L 2，4-D+0.5～1.0mg/L BA+0.5～1.0mg/L NAA+0.1～0.5mg/L TDZ+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/L CH+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；所述无菌试管苗的叶片接种时叶片的处理方法是：取无菌试管苗，从茎尖向下第3到第6片展开叶为材料，叶片带短叶柄，用手术刀片垂直于叶片背面主脉划3～4个伤口；(4)将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基上，培养形成丛生芽小苗，所述不定芽诱导培养基为：改良的MS+0.1～0.5mg/L BA+0.1～0.5mg/L NAA+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/L CH+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(5)将丛生芽小苗切成愈伤块转接到试管苗增殖培养基或不定芽诱导培养基上进行增殖快繁培养；(6)将增殖培养的丛生芽从基部切开，转入壮苗培养基中，进行壮苗培养，所述壮苗培养基为：改良的MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；(7)将壮苗培养后的小苗切成单株转接到生根培养基上培养后，即可炼苗移栽，所述生根培养基为：1/2改良的MS+0.1～0.5mg/L IBA+0～0.05mg/L NAA+5.0g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.8～6.0，所述1/2改良的MS是改良的MS全量减半；炼苗移栽的具体步骤为：将试管苗封口膜绑绳松开，在培养室适应1～2d，转入遮光度50％的温室中，去掉封口膜，炼苗2～3d，待小苗叶片上的气孔自主开合后，用镊子轻轻将小苗夹出，清水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质的花盆中，保持相对湿度在80％以上；所述各步骤中培养条件除特殊说明外，均为培养室温度白天25±2℃，夜晚18±2℃，光照强度1000～1500lx，光照时间16h/d；上述各步骤中的改良的MS，包括MS常量营养元素、MS微量营养元素和改良的MS有机试剂；所述MS常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，七水硫酸镁370mg/L，无水磷酸二氢钾170mg/L，二水氯化钙440mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L；所述MS微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：四水硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L；所述改良的MS有机试剂的组分和其对应的浓度如下：盐酸硫胺素10mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，肌醇100mg/L。