[发明专利]全细胞催化生产1; 5-戊二胺的大肠杆菌工程菌及应用

摘要

提供了全细胞催化生产1,5‑戊二胺的大肠杆菌工程菌及应用。所述工程菌，是在大肠杆菌B系列衍生菌株中过量表达赖氨酸脱羧酶基因cadA并同时适量表达赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因cadB构建的1,5‑戊二胺全细胞催化工程菌；还提供了利用该工程菌催化生产1,5‑戊二胺的方法。

主权项

1.工程菌，其特征在于，是在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因cadB；所述过表达赖氨酸脱羧酶基因是将改造的赖氨酸脱羧酶基因的全部核苷酸序列置于外源表达质粒中的启动子和RBS之后进行表达；所述适量表达赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因是指将包含RBS序列的赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因的全部核苷酸序列置于外源表达质粒中的赖氨酸脱羧酶基因的核苷酸序列之后进行表达；或，使用适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子替换大肠杆菌B株或其衍生菌株染色体上的赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因自身的启动子，所述适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子具体为T7启动子,所述在大肠杆菌B株或其衍生菌株中过表达赖氨酸脱羧酶基因，同时适量表达赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因cadB的方法为如下(1)或(2)所示：(1)将含有赖氨酸脱羧酶蛋白基因和包含RBS序列的赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因的片段导入所述大肠杆菌B株或其衍生菌株中；所述片段是通过重组表达载体导入的；所述重组表达载体具体是将所述片段插入pET28a(+)的多克隆位点间得到的；所述重组表达载体具体构建过程如下：将含有赖氨酸脱羧酶蛋白基因的片段插入pET28a(+)的NcoI和SalI酶切位点间，得到重组表达载体1；再将包含RBS序列的赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因的片段插入重组表达载体1的NotI和HindIII位点间得到；(2)将所述大肠杆菌B株或其衍生菌株的cadBA操纵子的启动子替换为适用于大肠杆菌的能解除cadB转录阻遏的启动子，再将含有赖氨酸脱羧酶蛋白的编码基因的片段导入所述大肠杆菌B株及其衍生菌株中；所述将大肠杆菌B株或其衍生菌株的cadBA操纵子的启动子替换为T7启动子的过程如下：将带有T7启动子序列的赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因的质粒导入所述大肠杆菌B株或其衍生菌株中进行同源重组得到；所述带有T7启动子序列的赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白的编码基因的质粒是将带有T7启动子序列的赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白的编码基因插入pKOV质粒的BamHI和NotI位点间得到；所述含有赖氨酸脱羧酶蛋白基因的片段是通过重组表达载体导入的；所述重组表达载体具体是将所述片段插入pET28a(+)的多克隆位点间得到的；所述重组表达载体具体构建过程如下：将含有赖氨酸脱羧酶蛋白基因的片段插入pET28a(+)的NcoI和SalI酶切位点间；所述赖氨酸脱羧酶基因是改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA，所述改造是指赖氨酸脱羧酶基因cadA的第二个密码子突变为大肠杆菌使用频率较高的第二位密码子；再将所述赖氨酸脱羧酶基因cadA的+7～+33位碱基进行同义密码子替换以增加稀有密码子个数并选择转录产生的mRNA二级结构的最小自由能低和翻译起始效率高的序列，所述改造的赖氨酸脱羧酶基因cadA的+1～+35位碱基包括:5’‑ATGGCAGTTATAGCAATATTGAATCATATGGGAGT‑3’5’‑ATGGCAGTTATAGCAATATTGAATCACATGGGGGT‑3’5’‑ATGGCAGTTATAGCAATATTAAATCACATGGGGGT‑3’5’‑ATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGAGT‑3’5’‑ATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCATATGGGAGT‑3’5’‑ATGGCAGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGT‑3’5’‑ATGGCAGTTATTGCAATATTAAATCACATGGGGGT‑3’5’‑ATGGCAGTTATTGCAATATTAAATCATATGGGAGT‑3’；所述赖氨酸‑戊二胺逆向转运蛋白基因如SEQ ID NO.2所示，所述RBS序列如SEQ ID NO.3所示。