[发明专利]双抗性CRISPR/Cas9载体及应用在审
| 申请号： | 201510992210.8 | 申请日： | 2015-12-24 |
| 公开（公告）号： | CN105543270A | 公开（公告）日： | 2016-05-04 |
| 发明（设计）人： | 刘军;于春生;姬荣桓;刘斌;赵涛;李宏宇;林辰涛 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院作物科学研究所 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/66;C12N1/21;A01H5/00 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君 |
| 地址： | 100081 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明涉及双抗性CRISPR/Cas9载体及应用。本发明提供一种同时具有潮霉素B和Basta抗性的双抗载体，其是通过将来源于多个不同载体的序列、片段经过酶切连接插入到载体pFGC5941的序列中，构建得到的。利用潮霉素B在转化过程中筛选，利用Basta在后代植株中进行不含有外源T-DNA序列的后代转基因植株的筛选。本发明首次利用潮霉素B和Basta两种抗性分别作为转基因植株的筛选标记，为筛选不含有外源T-DNA序列的转基因后代提供了一种可行方式，避免通过复杂的分子生物学检测实验确定外源T-DNA的存在，直接通过对Basta抗性的筛选和表型结合即可获得不含有外源T-DNA序列的后代转基因植株。 | ||
| 搜索关键词： | 抗性 crispr cas9 载体 应用 | ||
【主权项】：
双抗性CRISPR/Cas9载体，其特征在于，通过PCR扩增35S启动子和NOS终止子序列，利用重叠PCR将35S启动子和NOS终止子序列与体外合成的3×flag序列串联起来，将串联序列插入到载体pFGC5941的EcoRI和HindIII位点之间，得到载体I；通过PCR扩增gypsy绝缘子序列，将扩增得到的序列插入到载体I的EcoRI和HindIII位点之间，得到载体II；通过PCR扩增NLS‑cas9‑NLS序列，将扩增得到的序列插入到载体II的SpeI位点，得到载体III；最后通过PCR扩增35S:HPT序列，将扩增得到的序列插入到载体III的XbaI位点，即构建获得双抗性CRISPR/Cas9载体；其中，3×flag序列如SEQ ID NO:1所示，gypsy绝缘子序列如SEQ ID NO:2所示，NLS‑cas9‑NLS序列如SEQ ID NO:3所示，35S:HPT序列如SEQ ID NO:4所示。
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