[发明专利]一种鸭黄病毒的RT-LAMP检测方法

摘要

本发明公开了一种鸭黄病毒RT-LAMP检测方法，所述方法利用试剂盒完成，试剂盒包括以下组分：1）RT-LAMP反应液；2）引物混合液；3）酶混合物；4）目视荧光染料；5）DEPC水；6）阴性对照；7）阳性对照。检测方法具体步骤是：采集样品后提取核酸RNA，利用试剂盒进行PCR扩增，反应结束后进行结果检测。本发明的有益效果为：1）快速：从样品处理到出结果仅需2小时左右；2）实现了一步法RT-LAMP检测鸭黄病毒的目的；3）灵敏：使用该方法比传统PCR方法灵敏度高10～100倍；4）特异：与常见禽类其他病毒不发生交叉反应；5）操作简单，具有良好重复性。

主权项

一种鸭黄病毒的RT‑LAMP检测方法，其特征在于，所述方法利用试剂盒完成，所述试剂盒包括以下组分：RT‑LAMP反应液：内含浓度为8mmol/L MgSO₄，5.6mmol/L dNTP Mixture；2）引物混合液；检测鸭黄病毒的引物组按照F3:B3:FIP:BIP:LF:LB为5nM:5nM:40 nM:40 nM:20nM:20nM的比例混合；其中所涉及的检测引物序列为：上游内引物FIP序列：5’‑ GCGGCATGTTTCAGCGACTGCATGGTTCCACGGAAGCG ‑3’,下游内引物BIP序列：5’‑AACGCCCAAAAGTCCCGTCTACGGGGTTCACATTCGAGTGTG ‑3’.上游外引物F3序列:5’ ‑GCAGAAGGAAAACGTCCAGT ‑3’下游外引物B3序列：5’ ‑CCCATGTCAACCCCAGATC ‑3’,上游环引物LF序列5’ ‑GGCTGAATAATTGTGGTAGGTGCT ‑3’,下游环引物LB序列5’ ‑ACCGCTGAGATGGAGGATTATG ‑3’3）酶混合物：浓度均为5U/μL的AMV反转录酶与8000U/mL的Bst DNA聚合酶按1：1比例混匀分装；4）目视荧光染料；5）DEPC水：内含浓度为1‰的焦炭酸二乙酯；6）阴性对照：ddH2O；7）阳性对照：利用鸭黄病毒E基因构建的假病毒颗粒；所述的检测方法包括以下步骤：（1）采集样品后，将样品和本试剂盒中的阳性对照用常规试剂盒提取核酸RNA；（2）从上述试剂盒中取出RT‑LAMP反应液、酶混合物，引物混合液，DEPC水在室温下融化后，2000r/min离心5s；每管测试反应体系加入：RT‑LAMP反应液，7.5μL；引物混合液，6 μL；酶混合物，2μL；目视荧光染料，1μL；DEPC水，3.5μL；再分别加入处理后制备的阳性对照和样品的RNA溶液及阴性对照各5μL，盖紧管盖，于4000r/min离心5s；将PCR管排好，放入63℃水浴锅水浴1小时或是放入PCR仪运行63℃保温1小时；（3）检测目视检测方法：阴性对照呈现浅橘黄色，阳性对照呈荧光绿色，样品根据反应后管内液体的颜色进行判断阴性阳性；浊度检测方法反应结束后，将所有PCR管进行离心10000rpm，1min，观察管底，阴性对照管底无沉淀，阳性对照有白色沉淀，样品根据有无白色沉淀进行判断阴阳性；凝胶电泳检测方法用含溴化乙锭( EB) 的1.5%琼脂糖凝胶电泳；在紫外透射仪下观察核酸带；阳性对照扩增产物凝胶电泳后，可见从点样孔的拖尾现象以及很多不同扩增长度的条带，阴性对照无条带，样品根据电泳后条带有无进行判断阴阳性。