[发明专利]一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法

摘要

本发明公开了一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法，是采用三亲本杂交方法获得携带青色荧光CFP特性的內源荧光标记根瘤菌R.GN5f菌液，添加的天然植物源抑菌剂苦参碱混合接种生殖生长期的甘农5号紫花苜蓿根部。本发明的有益效果为：1）目标根瘤菌R.GN5f通过三亲本杂交获得，遗传稳定性好，获得容易，使用方便；2）苦参碱，对空气源和土壤源微生物抑制，对根瘤菌无抑制作用，促进根瘤菌在苜蓿体内的运移和定殖；且价格低廉，对环境无毒无害；3）获得含苦参碱的荧光标记根瘤菌液容易，接种操作简单，耗时短，适宜生长时期内可随时接种；4）添加苦参碱后促进了目标根瘤菌的运移和定殖，为获得携带有大量目标根瘤菌种子奠定基础。

主权项

1.一种目标根瘤菌在苜蓿植株体内运移和定殖的促进方法，其特征在于，包括以下步骤：1）选择菌株：选取的荧光标记根瘤菌Rhizobium meliloti.GN5f(R.GN5f)，其原始菌株Rhizobium meliloti.GN5(R.GN5)为分离自甘农5号紫花苜蓿(Medicago sativa cv .Gannong No.5)根瘤的优良根瘤菌株；通过三亲本杂交获得含有青色荧光蛋白（CFP）的內源荧光标记根瘤菌R.GN5f；2）选取植物材料：苜蓿材料为甘农5号紫花苜蓿；3）制备菌液：将步骤1）的菌株TY平板活化后转接入50mlTY液体培养基，28℃、180rpm/min振荡培养至菌液光密度OD600nm 值为0.5‑1，4000rpm/min离心5min，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用漩涡振荡器将其打散，最后用无菌水调制成OD600nm为0.5的R.GN5f荧光标记根瘤菌液；4）添加苦参碱：选取的苦参碱浓度为600mg/L，含量为1.3%，无菌操作台内苦参碱溶液用0.22μm无菌滤膜和无菌针管过滤灭菌后，添加至培养好的菌液中，至终浓度600mg/L；5）接种：分别随机选取现蕾期、初花期、结荚期的苜蓿植株5株，根部10cm范围内挖深约5cm坑，露出主根、侧根、毛根，将制备好的荧光标记根瘤菌液按50ml/株均匀浇灌于根部，尔后覆土埋根；未添加苦参碱的R.GN5f接种为对照；6）检测时期及检测组织：a）现蕾期～成熟期：检测根、茎、叶、花、种子；b）开花期～成熟期：检测根、茎、叶、花雌蕊的胚珠、花雌蕊的花柱、花雌蕊的柱头、花雄蕊的花药、花雄蕊的花丝、花瓣；c）结荚期～成熟期：检测幼嫩种子、成熟种子、荚果皮；7）检测方法：①取样：分别于现蕾期、初花期、结荚期采用添加苦参碱菌液浇灌的接种方法，接种后的5d、15d、30d、60d取样检测分析，直至种子收获，以未添加苦参碱的菌液浇灌为对照；取苜蓿单株，随机分离出5‑10cm深土层的毛根，茎、叶均随机取自同一植株，且分离为上部茎、下部茎、上部叶和下部叶、花丝、花瓣、胚珠、花柱、柱头、花药、荚果皮和种子；取样用自来水冲洗干净后自然晾干；手提紫外灯平板数量检测：根、茎、叶各称取1g，花5朵/花序、荚果皮5个/花序、种子5粒/花序，放入50ml无菌三角瓶内，加入有效碘浓度为2500mg/L的碘伏消毒液淹没，震荡消毒4min后无菌水冲洗5次，至三角瓶内无泡沫状液体出现即可，完全消毒的组织分别置于无菌研钵中，加入2ml无菌水充分研磨后离心，离心转速为4000rpm/min，离心时间为5min，吸取0.2ml上清液均匀涂布于TY固体培养基，其中根研磨液依次稀释10¹‑10³，三次重复，28℃培养24‑48h后，黑暗中手提紫外灯下记录每皿内荧光标记根瘤菌数量，荧光标记根瘤菌在手提紫外灯下发青绿色光；③黑白体式荧光显微镜检测：黑白体式荧光显微镜视野下，绿光激发cfp显示白色，在检测中，含CFP标记根瘤菌的苜蓿组织为白色，未检出的组织为黑色。