[发明专利]一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法

摘要

本发明属于生物分析与检测技术领域，具体为一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法。本发明首先在Fe₃O₄@PEG磁性纳米材料表面修饰醛基、环氧基和三氟乙磺酸酯基等活性基团，再在其外层键合上含有二硫键的基团，得到磁性纳米材料Fe₃O₄@PEG@ADC；然后采用两步酶解的策略：先用胰蛋白酶进行第一步酶切，使疏水性的膜蛋白暴露出亲水性的羧基；然后再进行还原烷基化，破坏未被酶切的肽段与材料之间的二硫键；从材料表面洗脱下来的残余肽段继续被Glu‑C酶解。实验证明，两步酶解策略对于特殊膜蛋白，如细菌视紫红质，具有很好的酶解效果，在复杂样品的膜蛋白组学研究中也有很好的结果。本发明实用高效，重复性好，稳定性高，在膜蛋白的大规模鉴定中有广阔的应用前景。

主权项

1.一种基于蛋白质可逆固定的两步酶解鉴定方法，其特征在于具体步骤如下：（1）通过一系列反应将半光胺和乙酰半胱氨酸中的两个巯基相连，形成由二硫键连接氨基与羧基而得到的化合物，记为ADC；（2）利用ADC的氨基与表面修饰有三氟乙磺酸酯基的磁性纳米材料Fe₃O₄@PEG‑tresyl进行反应，形成表面含有丰富羧基的新型磁性纳米材料，记为Fe₃O₄@PEG@ADC；（3）将膜蛋白键合到新型磁性纳米材料Fe₃O₄@PEG@ADC表面；（4）用胰蛋白酶进行第一步酶解，使疏水性的膜蛋白暴露出亲水性的羧基，然后再进行还原烷基化，破坏未被酶切的肽段与材料之间的二硫键，将材料表面的残余肽段洗脱下来；再进行第二步酶解，即选用活性位点为谷氨酸的Glu‑C进行残余肽段的酶解；所述形成化合物ADC的具体操作过程如下：把0.5～1.0 mL偶氮二甲基二乙酯和200～400 mg 半胱胺溶解在10～20 mL二氯甲烷溶剂中，氮气氛围中室温下过夜反应；将二氯甲烷蒸干，然后使用柱层析分离对产物进行提纯，去除水相中未反应的半胱胺；将所得中间产物重溶在3～6 mL四氢呋喃中，并加入200～400 mg乙酰半胱氨酸，在氩气中40～60°C反应48～72 h；经过柱色谱分离后便得到较纯的ADC；步骤（2）所述形成表面含有丰富羧基的新型磁性纳米材料Fe₃O₄@PEG@ADC的具体操作过程如下：将所得ADC重溶在1～2 mL乙腈中，转移到20～40 mL PBS 缓冲溶液中，超声使其分散均匀；加入1.0～2.0 g表面修饰有三氟乙磺酸酯基的磁性纳米材料 Fe₃O₄@PEG‑tresyl，在室温下过夜反应；再磁性分离，去除未反应ADC，加入封闭缓冲液，反应去掉多余的tresyl活性基团；反应0.5～1 h后，除去多余封闭缓冲液，然后分别用水、乙醇洗涤数次，即得到新型磁性纳米材料Fe₃O₄@PEG@ADC，烘干待用；步骤（3）所述将膜蛋白键合到新型磁性纳米材料Fe₃O₄@PEG@ADC表面的具体操作过程如下：使用EDC和NHS对Fe₃O₄@PEG@ADC磁性纳米材料表面的羧基进行活化：EDC和NHS按照1：1～2：1的比例溶解在1～2 mL MES缓冲溶液中，再加入10～20 mg Fe₃O₄@PEG@ADC磁性纳米材料，常温下活化0.5～1 h后磁性分离，去除多余的反应物；细菌视紫红质蛋白溶解在含有4%SDS的2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液（MES），配制成浓度为0.5～1.0 mg/mL的蛋白溶液；将Fe₃O₄@PEG@ADC磁性纳米材料重新分散在90～180 μLMES缓冲溶液中，并加入 10～20μL蛋白溶液，在30～40°C条件下，震荡反应2～3小时；步骤（4）所述进行两步酶解的具体操作过程如下：将所得材料经过充分洗涤后，重新分散在50～100 μLNH₄HCO₃溶液中，进行两步法酶解：第一步，加入1.0～2.0 μg Trypsin，30～40°C下过夜酶解；磁性分离后分别得到1号肽段样品；第二步，材料中加入10～20mM DTT溶液，在50～60°C下反应45 min～1 h，随即加入IAA至终浓度为25～50mM，在室温下避光反应0.5～1 h；磁性分离后得到还原烷基化的残余肽段，并加入0.5～1.0 μgGlu‑C，继续在37°C下过夜酶解，得到2号肽段样品；两个肽段样品冻干后进行RPLC‑MS/MS分离鉴定。