[发明专利]一种山核桃RCA基因克隆的方法

摘要

本发明公开了一种山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于:包括以下步骤：a)取材、b)提取RCA、c)序列检索、d)引物设计、e)目的片段克隆及测试、f)RCA基因组序列分析、g)生物信息学分析、h)总RNA提取和不同时期叶片的定量分析，本发明利用RACE和RT-PCR技术，克隆获得山核桃2个RCA基因全长，结合生物信息学分析，分析了在碱基序列、编码氨基酸序列及其他特性差异，并通过不同发育时期叶片的RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式，为利用基因工程手段调控RCA以增加光合速率和提高抗逆性打下基础。

主权项

一种山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：a)取材：每隔一周于午后取同株不同枝头最外侧幼叶或叶片，迅速液氮冷冻处理后，并置于‑70℃冰箱中进行保存；b)提取RCA：对步骤a)处理后的幼叶或叶片进行RCA提取；c)序列检索：通过克隆和比对确认山核桃存在2个RCA基因，利用β型RCA的ORF的序列作为查询标记，在山核桃基因组中进行同源匹配；d)引物设计：根据步骤c)获取的序列信息使用Primer Premier 5.0软件和primer 3.0在线(http：//bioinfo.ut.ee/primer3‑0.4.0/)设计基因特异性引物用于cDNA、基因组DNA的PCR扩增和定量分析；e)目的片段克隆及测试：根据已有同源基因保守序列和部分转录组序列，以叶片总RNA反转录的cDNA为模板，利用一对特异性引物扩取中间片段，预测产物大小550bp，以β‑Actin作为内参基因，根据确认的RCA基因中间序列，通过3’RACE特异性引物和5’RACE特异性引物获取基因cDNA的5’端和3’端序列，将DNA片段插入进T载体，阳性克隆然后进行测序；f)RCA基因组序列分析：基因组DNA参照CTAB法从山核桃叶片中提取，经RNase消化后作为扩取RCA基因组DNA片段的模版，根据已有的cDNA和基因组DNA序列设计的引物扩取相应的DNA序列，测序后使用DNAMAN进行多序列比较分析；g)生物信息学分析：利用ExPASy的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)程序，计算蛋白质物理化学性质，包括相对分子量、氨基酸组成、总平均亲水性等；利用PsiPred程序(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，进行蛋白质二级结构预测；利用SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序，预测蛋白质的信号肽；使用ChloroP 1.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)程序，预测蛋白质序列的叶绿体转运肽(cTP)；采用PSORT(http://www.psort.org/)程序，进行蛋白质亚细胞定位预测；使用ClustalX2.1进行蛋白同源序列比对；采用MEGA 5.05软件，进行氨基酸的多序列比对和系统进化树分析；h)总RNA提取和不同时期叶片的定量分析：采用改良的CTAB法与试剂盒(TaRaKa MiniBEST UniversalRNA Extraction Kit)联合使用提取不同生长时期叶片的总RNA，以提取所得总RNA为模板，OligodT为引物，按照Reverse Transcriptase M‑MLV(RNase H‑)试剂盒(TaKaRa)操作说明书合成cDNA第一链，稀释5倍后用以RT‑qPCR检测基因的相对表达量。