[发明专利]一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白，是由人类免疫缺陷病毒的反式激活转导蛋白Tat的蛋白转导域、人内皮抑素以及来自纤维细胞附着域的RGD三肽构成。本发明还公开了该Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白的制备方法，以及在制备治疗由新生血管生成引起的疾病的治疗药物中的应用和在在制备抑制内皮细胞迁移的药物中的应用。本发明的Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白保留了内皮抑素抑制新生血管增生的活性，能够穿过血脑屏障或眼球屏障与新生血管处过表达的整合素特异性结合，融合蛋白的靶向性和停留时间得到了极大的提高。

主权项

1.一种Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白，其特征在于，氨基酸序列如下：YGRKKRRQRRRHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASKCRGDC；所述Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白的制备方法，步骤如下：(1)融合基因的构建：采用常规方法制备含有编码Tat PTD‑Endostatin的目的基因和编码三肽RGD的目的基因的Tat‑Endostatin‑RGD融合基因，并扩增；(2)采用限制性内切酶Bam HI、Xho I分别酶切质粒pET28a，并回收酶切产物，采用Gibson assembly的方法连接酶切质粒和Tat‑Endostatin‑RGD融合基因；(3)将步骤(2)的连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及DNA测序分析鉴定重组质粒pET28a/Tat PTD‑Endostatin‑RGD，并获得最终重组表达质粒pET28a/Tat PTD‑Endostatin‑RGD；(4)采用热激法将表达质粒转化入大肠杆菌Origami 2(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素、链霉素和四环素的LB平板上培养，筛选转化子单菌落并抽提质粒进行PCR验证，获得阳性转化子；(5)将上述阳性转化子发酵，分离纯化得到发酵产物，鉴定发酵产物即为Tat PTD‑Endostatin‑RGD重组蛋白。