[发明专利]一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用

摘要

本发明公开了一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用。本发明构建的CRISPR/Cas9基因载体，包括复制起始位点、筛选标记基因、Cas9蛋白基因、gRNA的编码DNA、同源重组元件和操纵子。本发明构建的CRISPR/Cas9基因载体能够对大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌基因组进行编辑(包括基因或者DNA序列的敲除、置换、插入等操作)，具有试验周期短、节省时间和成本、效率高等优点。

主权项

1.载体，包括复制起始位点、筛选标记基因、Cas9蛋白基因和gRNA的编码DNA，所述gRNA识别受体菌的目的DNA，所述受体菌的目的DNA具有5’‑(N)X‑NGG‑3’结构，(N)X表示X个N，N为A、G、C或T，X为大于5的一个自然数；其特征在于：所述受体菌为大肠杆菌；所述载体包括同源重组元件和操纵子；所述同源重组元件含有用于进行同源重组的DNA片段，所述同源重组元件通过与所述受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组从而实现所述靶位点的基因组编辑；所述操纵子调控所述Cas9蛋白基因的转录，或调控所述Cas9蛋白基因和所述gRNA的编码DNA的转录；所述操纵子为阿拉伯糖操纵子；所述载体含有终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子和启动所述gRNA的编码DNA转录的启动子；所述阿拉伯糖操纵子由操纵区域和调控蛋白基因组成；所述载体由所述操纵区域、与所述操纵区域连接的所述Cas9蛋白基因、与所述Cas9蛋白基因连接的终止所述Cas9蛋白基因转录的终止子、与所述终止子连接的启动所述gRNA的编码DNA转录的启动子、与所述启动子连接的所述gRNA的编码DNA、与所述gRNA的编码DNA连接的所述复制起始位点、与所述复制起始位点连接的所述阿拉伯糖操纵子、与所述阿拉伯糖操纵子连接的同源重组系统、与所述同源重组系统连接的orf60a基因，与所述orf60a基因连接的所述同源重组元件、与所述同源重组元件连接的所述筛选标记基因组成；所述同源重组系统为Red同源重组系统。