[发明专利]基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用

摘要

本发明基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用，是将传统的金属离子荧光检测方法与金属纳米标记免疫技术相结合并应用于免疫检测中，它解决了传统荧光分子与生物蛋白分子连接困难的问题，实现了对检测信号的有效放大，解决了酶催化反应对实验条件要求苛刻而产生的问题；本发明在免疫检测中采用磁珠作为抗原、抗体的载体，能实现对待测样品的快速分离，使检测过程更简便快速，使检测的准确性、灵敏度都有很大的提高；本发明利用化学反应代替传统的酶催化过程并将荧光检测方法引入生物免疫检测，缩短了反应时间，提高了体系的稳定性，降低了检测成本，可在免疫分析检测及临床研究中发挥重要作用。

主权项

基于金属离子特异响应的荧光检测法在免疫检测中的应用，其特征在于，其具体操作步骤如下：(1)采用酶标板作为抗原、抗体的载体酶标板可采用96孔酶标板、48孔酶标板或384孔不同孔数的酶标板，所述酶标板均包含可拆与不可拆两种型号，酶标板的颜色包含黑色、白色以及无色透明色；(2)制备银离子荧光检测液①采用化合物A作为银离子荧光分子；所述化合物A的结构式为：式中，Et＝乙基；所述化合物A自身处于一种荧光关闭的状态，没有荧光；但是，当有银离子存在时，银离子会与化合物A发生反应，致使化合物A的结构发生改变而转换成化合物B；化合物B自身却有着很强的荧光，从而能实现一个荧光从无到有的变化：式中，Et＝乙基；②银离子荧光检测液的配置将银离子荧光分子溶于含20％乙醇的乙醇与水的混合溶剂中，构成混合溶剂并使银离子荧光分子的最终浓度保持在1～20μM；向混合溶剂中分别加入双氧水与磷酸的水溶液，保持溶液中双氧水和磷酸的最终浓度分别为10～100mM和1～20μM；超声，使各成分混合均匀；然后置于4℃条件下保存备用；③对制得的银离子荧光检测液的测试取100μL银离子荧光分子溶液注入10μL的20～50μM硝酸银溶液，反应10min后，用530～560nm可见光激发，可观察到明显的荧光产生，采用荧光分光光度仪测试，在585nm处有强的荧光，即认为该银离子荧光检测液对银粒子有灵敏的响应，可应用于免疫检测；(3)制备银标抗体①将银纳米颗粒与抗体结合，选择直径为5nm～200nm的银纳米颗粒：取10mL的1～20nM银纳米颗粒溶液加入1～5μL 5mg·mL‑1的AFP多克隆抗体，将混合好的溶液置于摇床上混合12～24h；②向得到的银标抗体溶液中加入200μL 1～5％牛血清白蛋白(BSA)，对银纳米颗粒表面没有结合甲胎蛋白多克隆抗体的部分进行封闭，25℃摇床上混合12h，后置于4℃条件下保存备用；③对制得的银标抗体的测试Ⅰ、经紫外可见吸收光谱表征，证明获得的是银标抗体；Ⅱ、经抗体活性测试，证明银标抗体保持了原有的抗体活性；Ⅲ、结论：制备的银标抗体可用于免疫检测；(4)进行免疫检测。