[发明专利]一种苯二氮卓人工抗原的制备方法

摘要

本发明提供了一种苯二氮卓人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测以氯氮卓与丁二酸酐为原料通过化学修饰，接臂，反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备苯二氮卓的人工抗原即苯二氮卓-牛血清蛋白。所制备的苯二氮卓人工抗原可进行动物免疫，取得相应的苯二氮卓抗体，可用于各种苯二氮卓类免疫分析法的研究，为苯二氮卓的检测提供更加方便快速准确的途径。

主权项

一种苯二氮卓人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备人工半抗原：(a)将氯氮卓溶于无水吡啶，加入乙酸酐，室温静置反应14小时以上；减压浓缩，加入乙醚：石油醚＝1：1溶剂，冰水浴结晶，移除溶液，固体用二氯甲烷溶解后减压浓缩；重复以上操作至TLC检测显示只有1个点，蒸干后称重，得产物Ⅰ；TLC层析液：正庚烷：三氯甲烷：乙酸：乙醇95％＝5:5:1:0.3(v/v)；(b)产物Ⅰ按比例加入1，4‑二氧六环溶解后，加入1N盐酸，室温静置14小时以上，反应比例：产物Ⅰ：1，4‑二氧六环：1N盐酸＝85.4g：1250ml：250ml；用1N氢氧化钠调反应液pH＝8～9，用乙醚萃取，收集有机相用pH＝9～10的氢氧化钠水溶液萃取，得到的水相用乙酸调pH＝7后，用二氯甲烷萃取，收集有机相减压浓缩，加入少量石油醚，使固体析出，蒸干得产物Ⅱ；(c)产物Ⅱ溶于乙酸酐中，反应比例：产物Ⅱ：乙酸酐＝1g：10ml，94℃下反应20～23分钟，冷却结晶过夜；移除溶液，固体用乙酸酐洗涤；加入95％乙醇，减压蒸干，得产物Ⅲ；(d)产物Ⅲ加入95％乙醇和4N氢氧化钠，反应比例：产物Ⅲ：95％乙醇：4N氢氧化钠＝3.4g：80ml：6ml，得乳白色悬浊物，加入与95％乙醇体积相同的纯化水溶解，用乙酸调至酸性，析出沉淀后，过滤，滤渣放入40℃烘箱中干燥过夜，得产物Ⅳ；(e)称取200mg产物Ⅳ，溶于5ml无水吡啶中，加入250mg丁二酸酐，95～105℃反应16小时以上；反应结束后，将溶剂减压蒸干，用38％的碳酸钾溶解，用乙酸乙酯萃取，收集水相，用盐酸调pH＝5，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，再用饱和氯化钠萃取，有机相减压蒸干，得苯二氮卓半抗原；(2)制备苯二氮卓人工抗原：(f)将苯二氮卓半抗原溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，加入N‑羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺，反应比例：苯二氮卓半抗原：N,N‑二甲基甲酰胺：N‑羟基琥珀酰亚胺：环己基碳酰二亚胺＝200mg：10ml：200mg：288mg，室温搅拌反应16小时以上，反应结束后离心取上清液记为A液；(d)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；(e)将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；(f)将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2‑8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；(g)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：苯二氮卓‑牛血清蛋白。