[发明专利]一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法

摘要

本发明公开了一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法，它包括下述步骤：1）采样布点；2）样品采集；3）样品预处理；4）DNA提取；5）实时荧光定量PCR；6）高通量测序；7）数据库建立；8）潜在病原微生物种类和丰度分析。本发明可对某一饮用水管网不同类型管道生物膜微生物群落（包括细菌和真核微生物）进行监测分析，并确定该管网生物膜潜在病原微生物种类和丰度。在饮用水管道生物膜检测方面，与传统培养方法相比，本发明具有检测时间短、分析结果全面等优点，对系统深入地评价饮用水管网潜在微生物风险，优化管网管道配置有重要意义。

主权项

一种饮用水管网管道生物膜微生物群落监测分析方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）样品采集：在无菌条件下对管壁生物膜进行采集，获得管壁生物膜样品；2）样品预处理：将管壁生物膜样品摇床振荡，摇床振荡转速设置为160‑200转每分钟；通过70‑80目的筛网进行过筛，并将其制成生物膜悬液，将生物膜悬液离心，离心转速设置为6000‑8000转每分钟，使离心管管底的离心沉淀物富集至0.5‑1g，离心后的样品如不能立即进行DNA提取，样品需置于‑20℃以下温度冻存；操作过程中与管壁生物膜样品直接接触的所有物品进行灭菌处理；3）DNA提取：提取步骤2）离心沉淀物中的总DNA；4）PCR扩增步骤3）总DNA中的细菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA目标基因序列，将两种目标基因序列分别导入质粒，制备质粒标样；将质粒标样10倍梯度稀释后进行荧光定量PCR，根据每个稀释度的循环阈值和基因拷贝数绘制细菌和真核微生物定量标准曲线，其中：定量标准曲线的R²>0.99，每个稀释度重复3次荧光定量PCR，3次的循环阈值相差小于0.5后，取其平均值用于绘制定量标准曲线；对步骤3）总DNA进行荧光定量PCR，并重复3次，3次的循环阈值相差小于0.5后，取其平均值作为样品循环阈值，根据样品循环阈值和定量标准曲线计算管壁生物膜样品的细菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA基因拷贝数；5）高通量测序：通过高通量测序获取步骤3）总DNA中细菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA目标基因序列；6）数据库建立：利用Mothur软件对步骤5）中总DNA中细菌16S rRNA和真核微生物18S rRNA目标基因序列进行质量控制，获取优质序列；其质量控制标准为：引物错配率和模糊碱基数低于2，序列评分高于85，序列长度为300‑500bp，无嵌合体；将优质序列分别与Silva细菌库或真核微生物库序列进行比对，确定生物膜样品细菌和真核微生物的系统分类，建立管网管道生物膜微生物数据库；7）潜在病原微生物种类和丰度分析：根据饮用水管网常见病原微生物库，从NCBI 获取该库中病原微生物16S rRNA或18S rRNA基因序列，建立饮用水管网常见病原微生物基因序列库，将步骤6）获得的优质序列与饮用水管网常见病原微生物基因序列库进行比对，确定潜在病原微生物种类及丰度。