[发明专利]一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法

摘要

本发明提供一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，步骤如下第一步，pLVX‑luciferase‑IRES‑ZsGreen1质粒的构建；第二步，慢病毒介导的luciferase过表达系统的建立；第三步，稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系的建立；第四步，裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立；第五步，炎症模型的建立；第六步，具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立继续饲养裸鼠30天，在裸鼠体内即建立具有炎症基础的胰腺癌模型。通过以上步骤建立得到的胰腺癌动物模型，可以通过使用的Luciferase，催化底物发光，被相应仪器设备检测到后就可以评估肿瘤的大小。

主权项

一种具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立方法，其特征在于步骤如下：第一步，pLVX‑luciferase‑IRES‑ZsGreen1质粒的构建：1) 通过下列反应体系和条件制备得到pLVX‑IRES‑ZsGreen1酶切产物和pGL3‑Basic酶切产物，其中DNA为pLVX‑IRES‑ZsGreen1和pGL3‑Basic质粒，反应体系：DNA，1 μg10×NEbuffer4+BSA，3 μL内切酶XhoI，1单位内切酶XbaI，1单位加灭菌超纯水至体积30 μL反应条件：37℃水浴2h2) 将pGL3‑Basic酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含1700bp大小的DNA片段的凝胶块，并采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到luciferase DNA片段，3) 将pLVX‑IRES‑ZsGreen1酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含8400bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的pLVX‑IRES‑ZsGreen1酶切产物，4) 采用T4 DNA连接酶和快速连接试剂盒，将luciferase DNA片段与纯化后的pLVX‑IRES‑ZsGreen1酶切产物进行连接，得到连接产物，5) 将连接产物转化入感受态大肠杆菌细胞，并进行抗性筛选，得到抗性筛选后的单克隆菌落，6) 将抗性筛选后的菌落进行阳性克隆筛选，得到pLVX‑luciferase‑IRES‑ZsGreen1质粒；第二步，慢病毒介导的luciferase过表达系统的建立：将pLVX‑luciferase‑IRES‑ZsGreen1质粒与辅助包装原件载体质粒pspax2和pMD2G用Lipofectamine 3000转染试剂转染293T细胞，即得慢病毒介导的luciferase过表达系统；第三步，稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系的建立：将慢病毒介导的luciferase过表达系统加入胰腺癌细胞培养液中，感染细胞，受感染的细胞，luciferase基因可整合至细胞基因组中，形成稳定表达luciferase的细胞，以终浓度4μg/mL嘌呤霉素筛选稳定表达luciferase的细胞，建立稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系；第四步，裸鼠胰腺原位移植瘤模型的建立：①将1×107个稳定表达luciferase的胰腺癌细胞系，重悬于DMEM培养液中，调整体积为100μL，细胞密度为1×107/100μL，再与100μL Matrigel等体积混合，得到细胞悬液，至于冰上备用，②采用胰岛素注射器，将50μL细胞悬液注射入裸鼠胰腺包膜下，即得裸鼠胰腺原位移植瘤模型；第五步，炎症模型的建立：以浓度为80%的乙醇为溶剂溶解DBTC，配制成3.2mg/mL的母液，在裸鼠胰腺原位移植瘤模型建立后第三天，将母液用等体积PBS稀释后进行DBTC尾静脉注射，即得炎症模型，其中按2mg/kg体重计算DBTC用量；第六步，具有炎症基础的胰腺癌动物模型的建立：继续饲养裸鼠30天，在裸鼠体内即建立具有炎症基础的胰腺癌模型。