[发明专利]一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法

摘要

本发明提供了一种检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法，包括以下步骤：血浆cfDNA提取、BCR H链的全长多重PCR扩增和TCRβ链CDR3多重PCR扩增、两种扩增产物等体积混合后再进行一次PCR扩增、高通量测序、免疫组库精准信息分析。上述三次PCR扩增的引物分别如SEQ ID NO.1‑28、SEQ ID NO.29‑77、SEQ ID NO.78‑79所示。本发明还提供了含有上述引物的检测血浆cfDNA中BCR和TCR的试剂盒。本发明方法以及试剂盒能够同时检测血浆cfDNA中BCR和TCR，实现精准信息分析和免疫组库各亚克隆的精确定量，在无创检测领域具有广阔的应用前景。

主权项

1.一种非诊断目的的检测血浆cfDNA中BCR和TCR免疫组库的方法，包括以下步骤：(1)血浆cfDNA提取；(2)BCR H链全长多重PCR扩增和TCRβ链CDR3多重PCR扩增；步骤(2)中BCR H链全长多重PCR扩增采用的上游引物共22条，序列分别如SEQ ID NO.1‑22所示，下游引物共6条，序列分别如SEQ ID NO.23‑28所示；TCRβ链CDR3多重PCR扩增采用的上游引物共45条，序列分别如SEQ ID NO.29‑73所示，下游引物共4条，序列分别如SEQ ID NO.74‑77所示；(3)步骤(2)中两种扩增产物混合后再进行一次PCR扩增；其中，步骤(3)所述的两种扩增产物分别是指BCR H链全长多重PCR扩增产物中片段大小在300‑350bp的片段回收纯化后的产物、以及TCRβ链CDR3多重PCR扩增产物中片段大小在200‑250bp的片段回收纯化后的产物；(4)高通量测序；(5)免疫组库精准信息分析，包括以下步骤：1)基于已知接头序列确定7个随机碱基N的位置，7个随机碱基可以形成47种唯一标签，将成对测序序列的测序序列1和测序序列2的唯一标签序列首尾相连，形成14bp的一条索引，并且以这14bp作为的成对测序序列索引进行外部排序，以达到将来源于同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的；2)对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据插入序列之间的汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉明距离不超过3，以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的；3)对于每个DNA模板扩增形成的系列重复片段中的测序序列的每一个测序碱基进行互相比对，若某种碱基型在测序序列中的一致率达到80％，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列，通过这种方法矫正，可以有效去除测序和PCR中随机引入的错误，提高检测的准确性；4)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；5)根据4)中得到的测序序列与IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量；6)根据5)的结果进行序列结构分析，免疫组库表达谱分析、Biomarker分析。