[发明专利]一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的生产方法

摘要

本发明公开了一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的生产方法，包括以下步骤：胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织；组织消化，得到细胞悬液；密度梯度密度分离，得到滋养细胞和胎盘间充质干细胞；滋养细胞的获得；胎盘间充质干细胞的培养。本发明采用HyQTase和DNAse I共同消化组织，经密度梯度分离获得大量的纯度和活力都比较理想的滋养细胞和胎盘间充质干细胞，且去除了消化碎片、成纤维细胞和红细胞，并把滋养细胞和胎盘间充质干细胞区分开来，获得的细胞滋养细胞纯度可达90％，胎盘间充质干细胞在培养时，在微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，并注入一种抗氧化剂，一直可以传代至第九或十代。

主权项

一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的生产方法，其特征在于包括以下步骤：(1)胎盘标本处理：无菌条件下将娩出胎盘剥除羊膜，剪除胎盘母体面2.0～3.0mm组织后，剪下胎盘小叶，称取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是将10～100μg/ml多聚赖氨酸加入到10～100μg/ml没食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡预定时间后，将剪下的胎盘小叶用手术剪剪碎，用生理盐水反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色，得处理后的胎盘组织；(2)组织消化：用15mmol/L三羟甲基氨基甲烷，加入哈特曼‑D溶液，调节pH至8.0，作为消化缓冲液，加入终浓度为2.4g/L HyQTase和300U/mL DNase I组成的消化液，取消化液320mL，将冲洗后的胎盘组织分多次进行消化，每次在37±0.2℃、180r/min恒温气浴摇床消化2min，消化完毕后，无菌去除HyQTase溶液，用新生牛血清终止消化反应，得到细胞悬液；(3)密度梯度密度分离：在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液，每个密度5mL，再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心20min，小心弃除离心管20mL刻度以上的液体，收集12.5～20.0mL刻度的细胞层和12.5～7.5mL刻度的液体，分别放入不同离心管里，用D‑Hank’s液稀释5倍后，室温下1000g离心15min，得梯度密度分离后的滋养细胞和胎盘间充质干细胞；(4)滋养细胞的获得：用含体积分数为10％胎牛血清的DMEM/F12、丙酮酸盐、10mg/L亚硒酸钠胰岛素、2mg/L乙醇胺和20毫μg/mL的bFGF配制成悬浮液，将密度梯度离心后的滋养细胞进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞，获得滋养细胞；(5)胎盘间充质干细胞的培养：用含体积分数为10％胎牛血清的DMEM/F12、丙酮酸盐、10mg/L亚硒酸钠胰岛素、2mg/L乙醇胺和20毫μg/mL的bFGF、增殖促进剂配制成悬浮液，将密度梯度离心后获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，计数并接种于75mm的培养瓶，放入37℃、二氧化碳浓度为0.5％的CO2培养箱中培养，2d换液1次，细胞生长至90％融合后，消化并计数细胞，按1∶4比例传代，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均一，变化形态明显的第2天用100ng/ml的BMP4处理，第3天或4用10ng/ml的BMP4处理，第5天用1ng/ml的BMP4处理，传至第8代时细胞开始出现老化现象，细胞增殖缓慢，细胞体积增大，胞浆中出现很多黑色颗粒，此时需要注入一种抗氧化剂，所述抗氧化剂为聚乙二醇‑缀合过氧化氢酶或N‑乙酰半胱氨酸，抑制间充质干细胞的衰老，用于增加干细胞产量，直到传至第九或十代。