[发明专利]一种猴子早期胚胎转基因敲入的PCR鉴定方法

摘要

本发明属于分子生物学及基因工程领域，涉及一种猴子早期胚胎转基因敲入的PCR鉴定方法。含有0.2‑0.5µl培养基的单个注射完的早期胚胎收集于薄壁透明PCR管底部；用枪头小心加入DLB裂解液5µl至PCR管底部，不要接触到含有胚胎的培养基;置于冰上裂解15‑30min释放基因组DNA;裂解产物直接全部用于全基因组扩增反应；然后用两轮巢式PCR扩增方法进行转基因敲入鉴定。本发明的方法能稳定地对少至只有16个细胞的猴子单个胚胎进行操作，所有操作步骤一直在同一PCR管中操作，防止操作过程造成微量基因组的丢失。同时，高保真横向扩增的方法拓展了基因组的下游应用，按照此方法可稳定、准确、简便地实现对猴子单个胚胎基因组敲入的快速PCR鉴定。

主权项

1.一种猴子早期胚胎转基因敲入的PCR鉴定方法，其特征在于：含有0.2‑0.5µl培养基的单个注射完的早期胚胎收集于薄壁透明PCR管底部；用枪头小心加入DLB裂解液5 µl至PCR管底部，不要接触到含有胚胎的培养基； 置于冰上裂解15‑30min释放基因组DNA; 裂解产物直接全部用于全基因组扩增反应；第一轮PCR反应体系：50 µl的反应体系中加入5 µl 10xExTaq Buffer、4 µl的2.5 mM dNTPs，10 µM引物各1.5 µl，0.25 µl TaKaRa ExTaq，1 µl全基因组扩增产物，其余为无菌水；98℃预变性10s后进入循环：98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸3min，40个循环，最后72℃延伸10 min；取5 µl扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测；以第一轮PCR产物为模版，分别用引物IF1、IR1以及IF2、IR2进行巢式第二轮PCR扩增，鉴定转基因敲入，PCR反应体系如同第一轮，退火温度为55℃，延伸时间为1min，对PCR产物进行克隆测序鉴定；设计左同源臂以外正向引物OF1及右同源臂以外反向引物OR2，以单个胚胎全基因组扩增产物进行第一轮PCR，鉴定基因组质量，同时对潜在的成功转基因敲入片段进行扩增，其次设计左同源臂以外，OF1以内的巢式正向引物IF1及插入片段上的反向引物IR1，以第一轮PCR产物为模版进行左臂插入的鉴定，设计右同源臂以外，OR2以内的巢式反向引物IR2及插入片段上的正向引物IF2，以第一轮PCR产物为模版进行右臂插入的鉴定；所述的OF1为5’‑TTCACTTGGCTTGCACGATGTTT‑3’，OR2为5’‑GCCCTGACTTGCTGTTCCTGAG‑3’； IF1为5’‑TCACTCACATAGCAACCACCAGG‑3’和IR1为5’‑CGCCATAGTCCATAGGACCAGGA‑3’，IF2为5’‑ ACATGGTCCTGCTGGAGTTCGT‑3’和IR2为5’‑ CGCCTGTGTCAGTACACCTTGG‑3’。